Dosage de complémentation de fragments protéiques
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le dosage de complémentation de fragments protéiques (PCA pour Protein-fragment Complementation Assay), est une technique de biologie moléculaire consistant à quantifier des interactions protéine-protéine en couplant chacune des deux protéines d'intérêt avec des fragments d'une troisième protéine et en testant la restauration de son activité. Les protéines d'intérêt (« appât » et « proie ») sont chacune liées de manière covalente à des fragments d'une « protéine rapporteuse » ((par exemple, la DHFR ou la luciférase, entre autres). Si les protéines appât et proie interagissement, elles permettent aux 2 fragments du rapporteur de se rapprocher. Celui-ci devient fonctionnel et on peut en mesurer l'activité.
Cette technique présente l'avantage de présenter moins de faux positifs que le double hybride. On peut la perfectionner en rajoutant des séquences d'intégrine entre protéine et sous-unité catalytique. L'intégrine, qui est une ligase, établit une liaison covalente entre les 2 protéines et reformer la luciférase.
Ce principe s'applique à de nombreuses protéines rapporteuses et constitue également la base du système double hybride de la levure, un test PCA archétypal.
Cependant, toutes les protéines ne peuvent être utilisées comme rapporteuse, en effet, il faut qu'elles possèdent des domaines bien distincts qui soient solubles lorsqu'ils sont séparés l'un de l'autre.
Rapporteurs
Toute protéine pouvant être scindée en deux fragments et reconstituée de manière non covalente pour former une protéine fonctionnelle peut être utilisée en PC). Toutefois, les deux fragments doivent présenter une faible affinité l'un pour l'autre de façon à n'être rapprochés que par les protéines interagissantes auxquelles ils sont liés (« appât » et « proie »), car la protéine appât permet d'identifier la protéine proie, voir figure). La protéine produisant un signal détectable est appelée « rapporteur ». Généralement, on utilise comme rapporteurs des enzymes conférant une résistance à la privation de nutriments ou aux antibiotiques, telles que la dihydrofolate-réductase ou la bêta-lactamase, ou des protéines émettant des signaux colorimétriques ou fluorescents. Lorsque des protéines fluorescentes sont reconstituées, le test PCA est appelé test de complémentation de fluorescence bimoléculaire.
Les protéines suivantes ont été utilisées dans les PCA à protéines scindées :
- Bêta-lactamase[1],[2] ;
- Dihydrofolate-réductase (DHFR)[3] ;
- Kinase d’adhésion focale (FAK)[4] ;
- Gal4, un facteur de transcription de levure (comme dans le système classique à double hybride de levure) ;
- GFP (GFP scindée), par exemple EGFP (protéine fluorescente verte améliorée)[5],[6],[7] ;
- Peroxydase de raifort[8] ;
- Protéine fluorescente infrarouge IFP1.4, un domaine de liaison au chromophore (CBD) modifié d’un bactériophytochrome de Deinococcus radiodurans[9] ;
- LacZ (bêta-galactosidase)[10] ;
- Luciférase[11],[12], dont ReBiL (luciférase bimoléculaire améliorée par recombinase)[13] et la luciférase de Gaussia princeps (en)[14] ; parmi les produits commerciaux utilisant la luciférase, on trouve NanoLuc et NanoBIT[15] ; une modification a également été développée pour les interactions associées aux gouttelettes lipidiques[16] ;
- FAST (splitFAST)[17] ;
- TEV (protéase du virus de la mosaïque du tabac)[18] ;
- Ubiquitine[19].
Application à l'échelle du génome
Les méthodes mentionnées ci-dessus ont été appliquées à des génomes entiers, par exemple celui de la levure[3] ou de la bactérie de la syphilis[20].
