Benutzer:Entinator/Calcium Imaging
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Calcium-Imaging bezeichnet Mikroskopieverfahren, bei denen der Calciumgehalt einer einzelnen Zelle, eines Gewebes oder einer Umgebung optisch gemessen wird. Dafür werden verschiedene Calciumindikatoren eingesetzt, das sind meistens fluoreszente Moleküle, deren Fluoreszenzeigenschaften sich infolge einer chemischen Bindung mit Calciumionen (Ca2+) verändern. Die Calciumindikatoren können in zwei grundlegende Klassen unterteilt werden: synthetische Indikatoren und genetisch codierte Indikatoren (abgekürzt GECI).[1] Indikatoren werden auch danach unterschieden, welche Signalart sie erzeugen. Intensiomerische Indikatoren zeigen die Calciumkonzentration durch eine veränderte Signalintensität bei gleichbleibender Wellenlänge an, wohingegen ratiometrische Indikatoren die Konzentration durch das Verhältnis zwischen zwei verschiedenen Fluoreszenzswellenlängen zeigen. Calciumionen dienen bei eukaryotischen Zellen als sekundärer Botenstoff.[2] Zum Beispiel wird die Bildung von Aktionspotentialen von einem schnellen Calciumeinstrom in die Nerven begleitet. Daher kann Calcium-Imaging genutzt werden, um die elektrische Aktivität hunderter Neuronen in Zellkulturen oder in lebenden Organismen zu überwachen, was ermöglicht, die Aktivität neuronaler Schaltkreise während laufenden Verhaltens zu beobachten. [3]
Synthetische Calciumindikatoren
Bei den synthetischen Indikatoren handelt es sich um kleine Moleküle, welche mit Ca2+ Chelatkomplexe bilden. Diese Moleküle basieren auf Chelatoren wie EGTA oder BAPTA (1,2-bis[o-Aminophenoxy]ethan-N,N,N′,N′-tetraacetat [4]), die eine höhere Affinität mit Calcium- als mit Magnesiumionen aufweisen, und mit fluoreszenten Chromophoren verbunden wurden. Zu diesen Indikatoren gehören Fura-2, Indo-1, Fluo-4 und Calcium-Green-1.
Diese Färbemittel können auf verschiedenen Wegen in die gewünschten Zellen gelangen. Häufig werden die Carboxygruppen des Chelators mit Acetoxymethyl verestert, damit diese lipophil werden und somit leichter durch die Zellmembran ins Zellinnere diffundieren können. (Diese Varianten werden mit der Endung AM im Namen gekennzeichnet.) Dort angekommen, werden die Carboxygruppen durch intrazelluläre Esterasen wieder freigelegt, sodass der Indikator Calciumionen binden kann.[1] [5] Alternativ können die Färbemittel unverändert in die Zellen eingebracht werden. Die Einführung der Indikatoren durch die Zellmembran erfolgt bei diesen Anwendungen etwa mit Patch-Pipetten, in Liposomen oder durch Elektroporation. Durch die Verwendung von Micropipetten oder -elektroden kann dabei gesteuert werden, welches Zellkompartiment den Indikator enthält. Eine weitere Form, in der die Indikatoren eingesetzt werden können, ist gekoppelt an Dextran.[6][5] Diese müssen, genau wie die unveränderten Indikatoren, invasiv in die Zellen gebracht werden, ermöglichen aber Calcium-Aufnahmen über längere Zeiträume.[6]
Ebenfalls unterscheiden sich die synthetischen Indikatoren in dahingehend, welche Fluoreszenzeigenschaft durch die Bindung mit Calciumionen verändert wird. Bei manchen, intensiometrischen Indikatoren führt die Bindung zu einer gesteigerten Fluoreszenzausbeute bei gleichbleibender Fluoreszenzwellenlänge, wodurch diese gut von anderen, im selben Präparat eingesetzten Fluoreszenzfarbstoffen unterschieden werden können. [6] Bei anderen führt die Bindung zu einer Veränderung der Anregungs- oder Emissionswellenlänge. Die Calciumkonzentration kann dabei ratiometrisch, also aus dem Verhältnis zwischen der Fluoreszenz zweier verschiedener Wellenlängen genau bestimmt werden.[6][7]
Genetisch codierte Calciumindikatoren
Genetisch codierte Calciumindikatoren (englisch: Genetically Encoded Calcium Indicators, abgekürzt GECI) werden eingesetzt, um intrazelluläre Calciumsignale und physiologische Prozesse in lebenden Organismen aufzuzeichnen.[8][9][10][11] Diese müssen nicht durch den Experimentator in die Zellen geladen werden, stattdessen werden sie von den Zellen selbst exprimiert. Das ermöglicht es, gezielt das Calciumsignal von bestimmten Zelltypen oder während bestimmter Entwicklungsstadien zu visualisieren. Dafür werden die Gene, die diese Proteine codieren, mit Transfektionsverfahren in die gewünschten Zellen gebracht, oder es werden transgene Versuchstiere erzeugt, die diese Gene gesteuert durch ausgewählte Promotoren exprimieren. GECIs wurden für die Untersuchung von Neuronen,[12][13] T-Zellen,[14] Herzmuskelzellen,[15] und anderen Zellarten eingesetzt. Einige dieser Indikatoren emittieren Photonen, wenn sie Calcium binden (Biolumineszenz), aber die meisten Indikatoren enthalten fluoreszente Proteine als Reporter. Dabei handelt es sich oft um das von der Qualle Aequorea victoria natürlich hergestellte grün fluoreszierende Protein (GFP) oder Varianten davon (eGFP, YFP, CFP). Die fluoreszenten Calciumindikatoren können in zwei verschiedene Systeme eingeteilt werden. Das eine besteht aus einem einzelnen, meist zyklisch-permutierten fluoreszenten Protein, das andere aus einem Paar fluoreszenter Proteine, mit denen die Calciumkonzentration ratiometrisch bestimmt wird.[16][17]
Indikatoren mit einzelnem fluoreszierenden Protein
Zu den ersten entwickelten GECI mit einzelnem fluoreszenten Protein gehören die sogenannten Camgaroos. Dieses Konstrukt nutzt das calciumbindende Protein Calmodulin, welches in die Mitte eines gelb fluoreszierenden Proteins (YFP für yellow fluorescent protein) eingebaut wird. Durch semi-zufällige Mutagenese des Proteins wurde ermittelt, dass das Einfügen neuer Reste an der 145. Position seiner Aminosäurensequenz nicht die Fluoreszenz des YFP beeinträchtigt. Das YFP wird zusätzlich zyklisch permutiert, indem der natürliche N- und C-Terminus des Proteins durch ein kurzes Peptid (GGTGGS) verbunden und anstelle der 145. Aminosäure neue Termini erzeugt werden. Diese werden mit einem Calmodulin fusioniert. Wenn das Calmodulin ein Ca2+-Ion bindet, sinkt der Säuredissoziationswert (pKa) des YFP-Chromphors, sodass er leichter deprotoniert und die Fluoreszenz des YFP somit zunimmt.[18]
Der 2001 entwickelte Indikator GCaMP nutzt ebenfalls ein zyklisch permutiertes GFP, bei dem der natürliche C- und N-Terminus mit einem kurzen Peptid verbunden sind. Der neue C-Terminus ist mit Calmodulin (CaM in der Abbildung) fusioniert, der N-Terminus mit M13 (einer Calmodulin bindenden Domäne der Myosin-leichte-Ketten-Kinase)[19]. Das Protein wurde so entwickelt, dass die Termini nahe beieinander liegen und die Bindung mit Ca2+ eine Konformationsänderung hervorruft: das mit Calcium verbundene Calmodulin geht wiederum eine Bindung mit M13 ein, wodurch der in der Mitte des GFP befindliche Chromophor von der wässrigen Umgebung geschützt wird und dadurch die Fluoreszenz des Chromophors zunimmt. GCaMP und darauf basierende Indikatoren haben eine nanomolare Bindungsaffinität.[20]
Einer weitere Art von Indikatoren mit einzelnem Protein gehört das CatchER an, das allgemein als Indikator mit geringerer Affinität gilt. Es handelt sich um ein EGFP (enhanced GFP) mit einer durch die Einfügung negativ geladener Reste künstlich erzeugten Calciumbindungsstelle. Durch die Bindung mit Ca2+ wird die starke negative Ladung abgeschirmt, sodass die Fluoreszenzinensität wiederhergestellt wird.[21]
Indikatoren aus zwei verschiedenen fluoreszierenden Proteinen
Der Prototyp für die Indikatoren aus zwei verschiedenen fluoreszenten Proteinen sind die sogenannten Cameleons. Diese bestehen aus zwei verschiedenfarbigen Proteinen, die zusammen ein Förster-Resonanzenergietransfer-Paar (FRET-Paar) bilden, Calmodulin, M13 und einem Glycylglycinlinker.[22] Solange kein Calcium gebunden ist, fluoresziert nur der FRET-Donor, das blauere der beiden Proteine. Durch die Bindung mit Calcium verbinden sich Calmodulin und M13, sodass das sich der Abstand zwischen den beiden fluoreszenten Proteinen verringert. Dadurch wird die Energieübertragung vom FRET-Donor zum FRET-Akzeptor ermöglicht, der dann langwelligeres Licht emittiert (siehe Skizze). Da die FRET-Effizienz von der vorliegenden Calciumkonzentration abhängt, erzeugen die Cameleons ein ratiometrisches Signal. Die ersten Varianten der Cameleons waren sehr empfindlich für den Säuregehalt der Umgebung, was in folgenden Varianten durch die Einbringung von zwei Mutationen reduziert wurde. [23]
| GECI | Jahr | Calciumersensor | Reporter | Vorgänger |
|---|---|---|---|---|
| Cameleons[24] | 1997 | Calmodulin | FRET-Paar: BFP oder CFP und GFP oder YFP | - |
| FIP-CBSM[25] | 1997 | Calmodulin | FRET-Paar: BFP und RFP | - |
| Pericams[26] | 2000 | Calmodulin | cpGFP | - |
| GCaMP[20][27] | 2000 | Calmodulin | cpEGFP | - |
| TN-L15[28] | 2004 | Modifiziertes skelletales Troponin C vom Huhn | FRET-Paar: YFP (Citrine) und CFP (Cerulean) | - |
| TN-humTnC[28] | 2004 | Kardiales Troponin C des Menschen | FRET-Paar: YFP (Citrine) und CFP (Cerulean) | - |
| TN-XL[29] | 2006 | Modifiziertes skelletales Troponin C vom Huhn | FRET-Paar: permutiertes YFP (Citrine) und CFP (Cerulean) | TN-L15 |
| TN-XXL[30] | 2008 | Modifiziertes csTnC in TN-XL | FRET-Paar: permutiertes YFP (Citrine) und CFP (Cerulean) | TN-XL |
| Twitch's[31] | 2014 | Troponin C | FRET-Paar: zwei verschiedene fluoreszierende Proteine | - |
| RCaMP1[32] | 2013 | Calmodulin | mRuby (rot fluoreszierendes Protein) | - |
| jRGECO1a[33] | 2016 | Calmodulin | mApple (rot fluoreszierendes Protein) | R-GECO[34] |
Nahinfrarot Indikatoren
Zunehmende Bedeutung erfahren Nahinfrarot (NIR) GECIs, die ermöglichen, mehrere verschiedenfarbige Indikatoren gleichzeitig im selben Gewebe einzusetzen, und deren Wellenlänge dickere Gewebeschichten durchdringt. Diese Indikatoren basieren nicht auf dem grün fluoreszierenden Protein der Quallen, sondern auf Biliverdin bindenden Proteinen, die größtenteils von bakteriellen Phytochromen abgeleitet sind. Dabei ist die Signalintensität im ungebundenen Zustand am höchsten und nimmt bei Calciumbindung ab. Dadurch besteht die Gefahr, dass sie bei kontinuierlicher Beleuchtung photobleichen.[35] Unter Verwendung zweier verschiedener NIR-fluoreszierender Proteine konnte auch ein NIR Cameleon-Analog entwickelt werden.[36]
Dauerhafte Fluoreszenzmarkierung
Eine besondere Klasse von GECIs ist so konzipiert, dass sie eine dauerhaft fluoreszierende Markierung in aktiven Neuronen erzeugt. Sie basiert auf dem photoschaltbaren Protein EosFP der Korallenart Lobophyllia hemprichii. Die Emissionsfarbe dieses Proteins ändert sich bei Bestrahlung mit violettem Licht, durch Spaltungsreaktionen in der Hauptkette, irreversibel von grün zu rot.[37] Der Calciumsensor CaMPARI kombiniert EosFP mit Calmodulin, sodass der Farbwechsel nur bei solchen Neuronen stattfinden kann, die zugleich violett bestrahlt werden und erhöhte Calciumspiegel aufweisen. SynTagMA ist eine synapsenspezifische Variante von CaMPARI2.[38]
| GECI | Jahr | Calciumersensor | Reporter | Vorgänger |
|---|---|---|---|---|
| CaMPARI[38] | 2015 | Calmodulin + violettes Licht | mEos: Farbwechsel von grün zu rot | - |
| CaMPARI2[39] | 2018 | Calmodulin + violettes Licht | mEos: Farbwechsel von grün zu rot | CaMPARI |
| SynTagMA[40] | 2020 | Calmodulin + violettes Licht | mEos: Farbwechsel von grün zu rot | CaMPARI2 |
| TubuTag[41] | 2021 | Calmodulin + violettes Licht | mEos: Farbwechsel von grün zu rot | CaMPARI2 |
Biolumineszente Indikatoren
Neben den weit verbreiteten fluoreszierenden Systemen existieren auch biolumineszente Systeme, die im Gegensatz zu den fluoreszierenden Systemen keine externe Lichtquelle zur Anregung benötigen. Dadurch bieten sie Vorteile wie die Einsetzbarkeit in stark autofluoreszierenden Proben, ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis, Vermeidung von Photobleichung und Phototoxizität durch die externe Lichtquelle.[42][43] Diese Systeme basieren häufig auf dem ebenfalls von Aequorea victoria isolierten Aequorin oder dem in Aequorin enthaltenen Luciferin Coelenterazin.[44]
Die Ca2+-Bindung bewirkt bei Aequorin eine Konformationsänderung, die die Oxidation des Coelenterazinmoleküls erleichtert. Das daraus resultierende Produkt emittiert blaues Licht, während es in den Grundzustand zurückkehrt. Die Fusion von Aequorin mit GFP ermöglicht einen Biolumineszenz-Resonanzenergietransfer vom Aequorin auf das GFP. Das führt zu einer 19- bis 65-fachen Emissionssteigerung des so erzeugten Calziumindikators gegenüber Aequorin allein.[43] Ein ähnliches System beruht auf rekombinant aus Obelia longissima gewonnenem Obelin und dem Luciferin Coelenteramid. Dieses System reagiert schneller auf Calciumkonzentrationsänderungen und ist unempfindlicher gegenüber Mg2+ als sein Aqueorin-Gegenstück.[45]
In dem als Nano-lantern bezeichneten Indikatorsystem ist die biolumineszente Luziferase RLuc8 aufgespalten und an verschiedenen Enden von Calmodulin angebracht. Die Calciumbindung führt die RLuc8-Komponenten zusammen, wodurch die Luziferase wiederhergestellt wird. Das von der Luziferase emmitierte Licht wird dann auf ein fluoreszierendes Akzeptorprotein übertragen.[21]
Durchführung
Ungeachtet der verwendeten Indikatoren ist die generelle Durchführung der Aufnahme ähnlich. Nachdem ein synthetischer Indikator in eine Zelle geladen wurde, beziehungsweise ein genetisch codierter Indikator in dieser exprimiert wurde, kann dessen Signal in einem Fluoreszenzmikroskop betrachtet und mit CMOS-Kameras[46] oder CCD-Kameras aufgenommen werden. Häufig wird Konfokalmikroskopie oder Zwei-Photonen-Mikroskopie eingesetzt. Bei diesen Verfahren wird immer nur ein kleiner Punkt des Präparats gleichzeitig angeregt und fokussiert. Dadurch ermöglichen sie eine hohe Auflösung in subzellulären Bereichen wie den Dornenfortsätzen und Synapsenendknöpfchen. Durch Auswahl verschiedener Fokusebenen können diese Verfahren in begrenztem Rahmen dreidimensionale Aufnahmen erzeugen. Zugleich werden durch das Anregungslicht verursachte Schäden an den betrachteten Zellen geringgehalten.[47] Als weiteres Verfahren zur Erzeugung dreidimensionaler Calciumaufnahmen wurde die Verwendung von Linsengittern wie bei einer Plenoptischen Kamera vorgeschlagen.[48]
Faserphotometrie
Um die Calciumaktivität von Nervenpopulationen zu bestimmen, die Signale zu einem bestimmten Areal senden, also bezüglich dieses Areals afferent sind, wurde die Faserphotometrie (englisch Fiber Photometry) entwickelt. Dafür wird eine optische Faser direkt oberhalb des Zielbereichs (ROI als Abkürzung für Region of Interest) implantiert. Durch die Faser werden Lichtimpulse zur Anregung der fluoreszenten Calciumindikatoren, üblicherweise GCaMP6, gesendet. Das emittierte Signal wird entweder von derselben oder einer zweiten optischen Faser zu einem Photodetektor geleitet. Dieses Verfahren ermöglicht die Aufnahme in mehreren ROIs gleichzeitig und kann bei Versuchstieren angewendet werden, die sich während der Aufnahme bewegen, hat aber eine geringe räumliche Auflösung.[49][50]
Miniatur-Mikroskopie
Die Verwendung von Miniaturmikroskopen erlaubt ebenfalls die Untersuchung von Calciumsignalen in sich bewegenden Tieren. Das Mikroskop wird dafür auf einer am Kopf des Tieres befestigten Plattform montiert und ein Microendoskop wird über der Zielregion implantiert. Durch das Endoskop wird das Anregungslicht und das resultierende Fluoreszenzsignal geleitet. Die dauehafte Befestigung der Plattform am Kopf ermöglicht es, über einen längeren Zeitraum hinweig mehrere Aufnahmen der selben Region zu machen.[51]
Auswertung
Die Aufnahmen werden analysiert, indem die Veränderungen der Fluoreszenzintensität für eine einzelne Wellenlänge oder zwei Wellenlängen, ausgedrückt als Verhältnis (ratiometrische Indikatoren), gemessen werden. Bei Bedarf können die abgeleiteten Fluoreszenzintensitäten und Verhältnisse gegen kalibrierte Werte für bekannte Ca2+-Konzentrationen aufgetragen werden, um die absoluten Ca2+-Konzentrationen zu messen. Der Dynamikbereich als Maß für den mit einer bestimmten Calciummessmethode erreichbaren Kontrast wird bei nicht-ratiometrischen Indikatoren üblicherweise als Verhältnis zwischen der Fluoreszenzintensität unter Ca2+-gesättigter und Ca2+-freier Bedingungen bestimmt. Bei ratiometrischen Indikatoren wird als Dynamikbereich das Verhältnis der maximalen FRET-Effizienz (Ca2+-gesättigt) zur minimalen FRET-Effizienz (Ca2+-frei) verwendet. Da lebende Zellen auch im Ruhestand Calcium enthalten und somit immer eine Grundfluoreszenz der Indikatoren vorliegt, wird hier als Signalstärke oft das Verhältnis von Fluoreszenzintensität zur Baseline- bzw. Grundfluoreszenzintensität (auf Englisch als SBR für signal-to-baseline ratio abgekürzt) angegeben.[21]
The use of near-IR wavelengths and minimization of axial spread of the point function[52] allows for nanometer resolution and deep penetration into the tissue.
This can be related to the SNR (signal to noise ratio) by multiplying the SBR by the square root of the number of counted photons.[21]
and two-photon microscopy[53][54] offer calcium imaging in freely behaving and head-fixed animal models.