Gegenfärbung
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Eine Gegenfärbung (engl. counterstain) bezeichnet in der Histologie und Zellbiologie eine histologische Färbung, die nicht den eigentlichen Gegenstand des Interesses färbt, sondern eine weitere Struktur, um dadurch einen Kontrast zu erzeugen und die Orientierung im Präparat zu ermöglichen. Der Begriff Gegenfärbung bezeichnet also die Funktion dieser Färbung und nicht eine bestimmte Färbemethode. So kann beispielsweise Hämatoxylin je nach Anwendungszweck für eine Färbung[1] oder eine Gegenfärbung[2] eingesetzt werden.
Eigenschaften
In der Histologie werden teilweise mehrere Farbstoffe als Gegenfärbungen verwendet und teilweise in einem Färbevorgang. Um den Farbkontrast zwischen den verwendeten Farbstoffen zu maximieren, können für die Gegenfärbung Farbstoffe in Komplementärfarben ausgewählt werden.[3]
Typische Beispiele für Gegenfärbungen findet man bei der Papanicolaou-Färbung,[4] der Von-Kossa-Färbung,[5] der Gimenez-Färbung, der Hämatoxylin-Eosin-Färbung,[6] der Wright-Giemsa-Färbung[6] und der Gram-Färbung. Bei den Trichrom-Färbungen werden mehrere Gegenfärbungen verwendet.
Die am häufigsten verwendete Gegenfärbung ist vermutlich die mit Eosin, um Cytoplasma darzustellen.[7.1]
Gegenfärbungen für die Fluoreszenzmikroskopie
In der Fluoreszenzmikroskopie fixierter Präparate wird häufig DAPI für die Gegenfärbung von Chromosomen oder Zellkernen eingesetzt. In der Regel wird mit DAPI nach der eigentlichen Färbung, zum Beispiel Antikörpernachweise oder Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung, gefärbt, kurz bevor das Eindeckmedium zugegeben wird.[7.2] DAPI hat den Vorteil, dass es blau fluoresziert und es wenig andere gute blaue Fluoreszenzfarbstoffe gibt, so dass der blaue Fluoreszenzkanal anderweitig kaum genutzt werden kann.
Prinzipiell können Gegenfärbungen in der Fluoreszenzmikroskopie unterschiedlich durchgeführt werden:
- Fluoreszierende Gegenfärbungen, die gleichzeitig mit der eigentlichen Färbung sichtbar sind
- Fluoreszierende Gegenfärbungen deren Anregungsbereich sich deutlich von der eigentlichen Färbung unterscheidet, so dass beide abwechselnd sichtbar gemacht werden können
- Mit Farbstoffen, die nicht fluoreszieren, sondern im normalen Durchlichtbild aufgenommen werden können und
- Mit Farbstoffen, die sowohl fluoreszieren, als auch im normalen Durchlichtbild aufgenommen werden können.[8]
Eine Gegenfärbung muss farblich deutlich von der eigentlichen Färbung zu unterscheiden sein und darf diese nicht überlagern. Sie darf die Färbung auch nicht quenchen und muss eine geeignete Gewebestruktur anfärben. Besonders geeignete Gegenfärbungen sind Zellkern-Färbungen, besonders DNA-Färbungen, da diese keine Signale im Cytoplasma verursachen. Auch Cytoplasma-Färbungen können verwendet werden.[8]
In Abweichung von dieser Regel wurde eine Gegenfärbung mit Evans Blau verwendet, um unspezifische Bindung von Fluorescein-markierten Antikörpern zu maskieren. Mit einem geeigneten Satz von Fluoreszenzfiltern können beide Farbstoffe mit um die 490 nm Licht angeregt werden, so dass grün-gelbe Fluoreszenz des Fluoresceins und rote Fluoreszenz von Evans Blau gleichzeitig beobachtet werden können. Schwache unspezifische Fluorescein-Signale sind dadurch nicht mehr sichtbar, wogegen starke spezifische Signale erkennbar bleiben. Es besteht jedoch die Gefahr, dass schwache spezifische Signale ebenfalls verloren gehen.[9]
Begriffsgeschichte
Das Verb „to counterstain“ (deutsch „gegenfärben“) lässt sich im Englischen erstmals 1895 nachweisen, in einer Arbeit von A. A. Kanthack and J. H. Drysdale.[10] Die älteste Erwähnung von „counterstain“ als Substantiv folgte 1899 durch G. Newman.[11]
In der deutschsprachigen Literatur wird „Gegenfärbung“ spätestens ab 1904 verwendet.[12] Der Begriff ist Fachleuten so selbsterklärend, dass er in Nachschlagewerken und Registern von Fachbüchern meist nicht als Stichwort aufgeführt wird, obwohl er im Text verwendet wird.[13][7.3]
Literatur
- Simon Renshaw: Immunohistochemistry and Immunocytochemistry: Essential Methods. Wiley, 2017. ISBN 978-1118-7-1775-2.