Cromatografía de afinidad
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La cromatografía de afinidad es una técnica de separación de una solución que utiliza la propiedad de sus componentes para unirse a determinadas moléculas. De forma general, consiste en hacer pasar la mezcla a través de un medio sólido en el cual quedará unido un componente mediante enlaces covalentes. Sus técnicas principales son la «inmunoafinidad», la «afinidad metálica» y la «pseudoafinidad».[1] Fue concebida y desarrollada por primera vez por Pedro Cuatrecasas y Meir Wilchek en 1968, como una forna de purificar proteínas.[2][3]
Principios
La cromatografía de afinidad se trata de separar componentes de una mezcla que contenga biomoléculas. Para ello se prepara un sustrato sólido que contenga un ligando unido mediante enlaces covalentes, con la capacidad de reaccionar con alguna molécula objetivo. La solución se hace fluir a través del sólido y la molécula objetivo se separa del resto. El sustrato ideal es aquel que mejor mantenga inmovilizado al ligando. Como, por ejemplo, acrilatos o geles de sílice. Para recuperar la sustancia purificada se puede variar alguna propiedad del ligando, como puede ser su pH o su concentración, o se añade alguna sustancia con mayor reactividad que la molécula objetivo. En cualquier caso, la sustancia purificada precipita y se puede recuperar. Para evitar que el ligando reaccione con cualquier componente de la mezcla se suele añadir un inhibidor, conocido como «espaciador». El inhibidor más utilizado es alguna cadena hidrocarbonada.[4]
Algunos ejemplos de interacciones que pueden utilizarse son:[5]
- Antígeno – anticuerpo.
- Enzima – sustrato.
- Receptor – ligando.
- Lectina – carbohidrato.
- Proteína – ácido nucleico.
Usos
Tiene un campo de aplicación muy amplio, ya que permite trabajar con proteínas, ácidos nucleicos, hormonas, enzimas y muchas otras biomoléculas. Entre las principales aplicaciones destacan la biotecnología, la biofarmacéutica, la investigación científica el diagnóstico médico, la industria alimentaria y la evaluación de impacto ambiental.[5] Etiquetar proteínas puede reducir tiempo y costos, ya sea desde un proyecto de investigación hasta usos industriales a gran escala. Lo que lo vuelve una opción más a considerar al aplicar esta técnica.[6]
Inmunoafinidad
Esta técnica utiliza un anticuerpo que se fija a una matriz para aislar una proteína de una mezcla compleja.[1] Los anticuerpos son proteínas que se unen firmemente a sus antígenos. Los vertebrados la producen como un medio de defensa contra las infecciones. Cada animal puede fabricar miles de millones de moléculas de anticuerpos diferentes. Cada anticuerpo reconoce su antígeno con gran especificidad. Justamente esta propiedad es fundamental en la utilización de esta técnica.
El procedimiento puede separarse en los siguientes pasos:
- Hay una columna con anticuerpos anti-A.
- Se adicionan las moléculas antígeno-A, y las no deseadas.
- Eluyen las moléculas no deseadas quedando las antígeno-A en los anticuerpos, más un poco de moléculas no deseadas.
- Se lava la columna y quedan solo los anticuerpos más su molécula antígeno-A.
- Finalmente eluye la molécula antígeno-A(que en este caso se quería separar).
Un soporte o matriz es la fase sólida a la que el anticuerpo es adherido y generalmente para darles este uso se encuentran activados, es decir que están provistos de un brazo espaciador el cual es logrado por una reacción química en la que se induce en la matriz ciertos grupos funcionales altamente reactivos,[7] lo que ayudara un mejor anclaje al anticuerpo. La matriz más usada para la unión de un anticuerpo es la agarosa cuyo nombre comercial es Sepharosa, pero también se conocen otras matrices de distinta naturaleza a las cuales se le pueden unir anticuerpos, y pueden dividirse dependiendo la utilidad que se les desee dar:[8]
- Materiales inorgánicos: vidrio, sílica, acero, arena.
- Polímeros orgánicos sintéticos generalmente hidrofóbicos: poliestireno.
- Polímeros orgánicos naturales principalmente hidrofílicos: agarosa, celulosa, almidón.
Industria farmacéutica
En la industria farmacéutica se utiliza esta técnica en la producción y purificación de proteínas recombinantes, en la obtención de hormonas como la insulina o la eritropoyetina, y en el desarrollo de vacunas y anticuerpos monoclonales.[5] Así mismo, se utiliza con frecuencia la técnica de etiquetado, que consiste en añadir a la proteína objetivo un péptido en uno de sus extremos para facilitar la unión con el ligante. Sin embargo esto presenta ciertas dificultades, ya que se debe proporcionar suficiente rendimiento y alta pureza para el producto final, preservando al mismo tiempo su estructura y funcionalidad. Aunque la variedad de etiquetas disponibles permite utilizarlas en más que solo la purificación, siendo útiles en muchas características bioquímicas y analíticas o pudiendo actuar como potenciadores de la solubilidad, entre otras propiedades útiles para el proceso de cromatografía.[6]
Las etiquetas más utilizadas incluyen la histidina (His), el glutatión S-transferasa (GST), la proteína de unión a maltosa (MBP) y la variante CL7 de la colicina E7. Las etiquetas de histidina tienen afinidad por los iones de níquel, cobalto, zinc, cobre y hierro que han sido inmovilizados formando enlaces covalentes coordinados con un agente quelante incorporado en la fase estacionaria. Para la elución se utiliza una cantidad en exceso de un compuesto capaz de actuar como ligando de iones metálicos, como el imidazol. Posteriormente, se aplica una proteasa activa y específica que libera la proteína de su etiqueta.[9]
Existe una técnica conocida como «cromatografía de afinidad débil» que consiste en caracterizar interacciones biológicas débiles o transitorias, para luego separar y purificar un analito para su estudio. Que, combinado con espectrometría de masas, permite detectar casi cualquier sustancia, incluso en mezclas complejas. Se utiliza tanto en diagnóstico como en el desarrollo de fármacos.[10]
