En , l'église paroissiale de l'abbaye est détruite par des iconoclastes. Nicolaas De Castro rédige un rapport en 1569 à la demande de Ferdinand Alvare de Tolède, à la suite d'une inspection des écoles de la Zélande.
Après le déclenchement de la révolte contre l'occupation espagnole, Middelbourg se range du côté des Espagnols. Pendant le siège de la ville, en , De Castro meurt de dysenterie. Joannes van Strijen lui succède, mais ne réside jamais dans son diocèse. En 1574, le commandant espagnol Mondragon doit se rendre à Guillaume d'Orange après un siège de deux ans. À la suite de la chute de la ville, les autorités catholiques se réfugient à Anvers et les protestants prennent possession de la cathédrale. Cela met fin de facto à la brève existence du diocèse de Middelbourg. L'évêque Van Strijen meurt à Louvain en 1594.
Le troisième évêque est Charles Philippe de Rodoan (Karel Filips de Rodoan) consacré en 1600, sans qu'il puisse prendre possession du siège, la ville étant occupée par les rebelles. En 1602, il est proposé comme évêque de Bruges, et sa nomination est confirmée par le pape quand le diocèse est formellement dissous le .
Le territoire du diocèse est ajouté à la juridiction de la mission de Hollande en 1622.
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