T4-DNA-Polymerase
Proteinfamilie
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T4-DNA-Polymerase ist ein Enzym aus der Gruppe der DNA-Polymerasen, das vom Gen 43 des Bakteriophagen T4 codiert wird.
| DNA-directed DNA polymerase | ||
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| Bändermodell der T4-DNA-Polymerase nach PDB 1NOY | ||
| Andere Namen |
Gene product 43, Gp43 | |
| Masse/Länge Primärstruktur | 898 Aminosäuren, 103.610 Da | |
| Bezeichner | ||
| Externe IDs | ||
| Enzymklassifikation | ||
| EC, Kategorie | 2.7.7.7 | |
| Orthologe (Bakteriophage T4) | ||
| Entrez | 1258685 | |
| UniProt | P04415 | |
| Refseq (Protein) | NP_049662.1 | |
| PubMed-Suche | 1258685
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Eigenschaften
Die T4-DNA-Polymerase dient dem Bakteriophagen T4 zur Replikation des viralen Genoms. Die T4-DNA-Polymerase besitzt zwei Enzymaktivitäten: eine Polymerase-Aktivität, die eine DNA-Synthese vom 5'- zum 3'-Ende katalysiert und eine 3'→5' -Exonuklease-Aktivität, die sogenannte Korrekturlese-Funktion (engl. proof reading), die es ermöglicht, den Einbau eines unpassenden Nukleotids zu erkennen und dieses anschließend wieder aus der DNA zu entfernen. Im Gegensatz zur DNA-Polymerase I aus E. coli fehlt ihr eine 5'→3'-Exonuklease-Aktivität. Die T4-DNA-Polymerase nutzt stets einen bereits bestehenden DNA-Einzelstrang als Matrize (Vorlage) für die Synthese eines neuen, komplementären Stranges. Voraussetzung für die Polymeraseaktivität sind ein 5‘-DNA-Überhang und eine hohe Konzentration an dNTPs.[1] Hohe Konzentrationen an dNTPs inhibieren die Exonukleaseaktivität. Die Exonukleaseaktivität zeigt eine im Vergleich zu doppelsträngiger DNA etwa 100-fache erhöhte Präferenz für Einzelstränge.[2] Als Cofaktor werden zweiwertige Magnesiumionen verwendet.
Funktion
Der Bakteriophage T4 codiert für alle Proteine, die er für seine Replikation benötigt. In den 1960er Jahren ist es gelungen, Genkarten für das T4-Genom zu erstellen.[3][4] 1964 gelang die Identifizierung des Gen 43 als Strukturgen für T4-DNA-Polymerase, die daher auch T4-gp43-DNA-Polymerase genannt wird.[5] T4-DNA-Polymerase ist eines von zehn Proteinen des T4-Replisoms, zu dem auch die T4-DNA-Ligase gehört.[6] T4-DNA-Polymerase gehört, wie die eukaryontische Pol α, zur Pol-B-Familie.[7] Als DNA-Klammer wird gp45 des Bakteriophagen T4 verwendet.
Anwendungen
Die T4-DNA-Polymerase wird in der Molekularbiologie zur Entfernung von 3´-Überhängen und zum Auffüllen (fill-in) von 5‘-Überhängen zur Erzeugung von glatten Enden (blunt ends) eingesetzt. Diese Funktion wird bei der Klonierung von DNA-Molekülen genutzt, die mit Restriktionsenzymen erzeugt wurden. Das Enzym wird auch zur Markierung von DNA-Molekülen eingesetzt, wobei man die Kombination von Exonuklease- und Polymeraseaktivität nutzen kann.[8] Ein Vorteil der T4-DNA-Polymerase bei der Zweitstrangsynthese während der cDNA-Klonierung ist die hohe Genauigkeit. Bei der ortsspezifischen DNA-Mutagenese findet sie Anwendung wegen der fehlenden strand displacement-Aktivität.
Literatur
- E. S. Miller, E. Kutter, G. Mosig, F. Arisaka, T. Kunisawa, W. Rüger: Bacteriophage T4 genome. In: Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. Band 67, Nummer 1, März 2003, S. 86–156, PMID 12626685, PMC 150520 (freier Volltext).