Electroforesis de ácidos nucleicos en gel
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La electroforesis de ácidos nucleicos es una técnica analítica utilizada para separar fragmentos de ADN o ARN por tamaño y reactividad. Las moléculas de ácido nucleico que se van a analizar se colocan sobre un medio viscoso, el gel, donde un campo eléctrico induce a los ácidos nucleicos (que están cargados negativamente debido a su esqueleto de azúcar-fosfato) a migrar hacia el ánodo (que está cargado positivamente porque se trata de una célula electrolítica en lugar de galvánica). La separación de estos fragmentos se consigue aprovechando las movilidades con las que moléculas de distintos tamaños pueden atravesar el gel. Las moléculas más largas migran más lentamente porque experimentan más resistencia dentro del gel. Como el tamaño de la molécula afecta a su movilidad, los fragmentos más pequeños acaban más cerca del ánodo que los más largos en un periodo determinado. Transcurrido un tiempo, se retira el voltaje y se analiza el gradiente de fragmentación. Para separaciones mayores entre fragmentos de tamaño similar, se puede aumentar el voltaje o el tiempo de funcionamiento. Las corridas prolongadas a través de un gel de bajo voltaje producen la resolución más precisa. Sin embargo, el voltaje no es el único factor que determina la electroforesis de los ácidos nucleicos.
El ácido nucleico que se va a separar puede prepararse de varias formas antes de la separación por electroforesis. En el caso de moléculas de ADN grandes, el ADN se corta con frecuencia en fragmentos más pequeños utilizando una endonucleasa de restricción del ADN (o enzima de restricción). En otros casos, como las muestras amplificadas por PCR, las enzimas presentes en la muestra que podrían afectar a la separación de las moléculas se eliminan por diversos medios antes del análisis. Una vez que el ácido nucleico se ha preparado adecuadamente, las muestras de la solución de ácido nucleico se colocan en los pocillos del gel y se aplica un voltaje a través del gel durante un tiempo determinado.
Los fragmentos de ADN de diferentes longitudes se visualizan utilizando un colorante fluorescente específico para el ADN, como el bromuro de etidio. El gel muestra bandas correspondientes a diferentes poblaciones de moléculas de ácido nucleico con diferente peso molecular. El tamaño del fragmento suele indicarse en "nucleótidos", "pares de bases" o "kb" (kilo-base pair kb o kbp para miles de pares de bases) dependiendo de si se ha separado ácido nucleico monocatenario o bicatenario. La determinación del tamaño del fragmento suele hacerse por comparación con marcadores de ADN disponibles en el mercado que contienen fragmentos lineales de ADN de longitud conocida.
Los tipos de gel más utilizados para la electroforesis de ácidos nucleicos son la agarosa (para moléculas de ADN relativamente largas) y la poliacrilamida (para la alta resolución de moléculas de ADN cortas, por ejemplo en la secuenciación del ADN). Los geles se han corrido convencionalmente en un formato de "losa" como el que se muestra en la figura, pero la electroforesis capilar ha cobrado importancia para aplicaciones como la secuenciación de ADN de alto rendimiento. Las técnicas de electroforesis utilizadas en la evaluación del daño del ADN incluyen la electroforesis en gel alcalino y la electroforesis en gel de campo pulsado.
En el caso de segmentos cortos de ADN, como el ADN bicatenario de 20 a 60 pb, su paso por un gel de poliacrilamida (PAGE) proporcionará una mejor resolución (condición nativa).[1] Del mismo modo, el ARN y el ADN monocatenario pueden pasarse y visualizarse por geles PAGE que contengan agentes desnaturalizantes como la urea. Los geles PAGE se utilizan ampliamente en técnicas como la huella de ADN, EMSA y otras técnicas de interacción ADN-proteína.
La medición y el análisis se realizan principalmente con un software especializado en análisis de geles. Los resultados de la electroforesis capilar suelen mostrarse en una vista de trazas denominada electroferograma.
Tamaño del ADN
Varios factores pueden afectar a la migración de los ácidos nucleicos: la dimensión de los poros del gel, el voltaje utilizado, la fuerza iónica del tampón y la concentración de colorante intercalante, como el bromuro de etidio, si se utiliza durante la electroforesis.[2]
El gel tamiza el ADN en función del tamaño de la molécula de ADN, por lo que las moléculas más pequeñas se desplazan más rápidamente. El ADN bicatenario se desplaza a una velocidad aproximadamente inversamente proporcional al logaritmo del número de pares de bases. Sin embargo, esta relación se rompe con fragmentos de ADN muy grandes y no es posible separarlos utilizando la electroforesis estándar en gel de agarosa. El límite de resolución depende de la composición del gel y de la intensidad del campo,[3] y la movilidad del ADN circular más grande puede verse más afectada que la del ADN lineal por el tamaño del poro del gel.[4] La separación de fragmentos de ADN muy grandes requiere la electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE). En la electroforesis en gel con inversión de campo (FIGE, un tipo de PFGE), es posible que se produzca una "inversión de bandas", en la que las moléculas grandes pueden moverse más rápido que las pequeñas.
Conformación del ADN
La conformación de la molécula de ADN puede afectar significativamente al movimiento del ADN, por ejemplo, el ADN superenrollado suele moverse más rápido que el ADN relajado porque está fuertemente enrollado y, por tanto, es más compacto. En una preparación normal de ADN plasmídico, pueden estar presentes múltiples formas de ADN,[5] y el gel de la electroforesis de los plásmidos normalmente mostraría una banda principal que sería la forma superenrollada negativa, mientras que otras formas de ADN pueden aparecer como bandas menores más tenues. Estas bandas menores pueden ser ADN mellado (forma circular abierta) y la forma circular cerrada relajada que normalmente se desplazan más lentamente que el ADN superenrollado, y la forma monocatenaria (que a veces puede aparecer dependiendo de los métodos de preparación) puede desplazarse por delante del ADN superenrollado. Sin embargo, la velocidad a la que se mueven las distintas formas puede cambiar si se utilizan diferentes condiciones de electroforesis, por ejemplo, el ADN lineal puede moverse más rápido o más lento que el ADN superenrollado dependiendo de las condiciones,[6] y la movilidad del ADN circular más grande puede verse más afectada que la del ADN lineal por el tamaño del poro del gel.[4] A menos que se utilicen marcadores de ADN superenrollado, el tamaño de un ADN circular como el plásmido puede medirse con mayor precisión después de haber sido linealizado mediante digestión de restricción.
El daño en el ADN debido al aumento de la reticulación también reducirá la migración electroforética del ADN de forma dependiente de la dosis.[7][8]
Concentración de bromuro de etidio
El ADN circular se ve más afectado por la concentración de bromuro de etidio que el ADN lineal si el bromuro de etidio está presente en el gel durante la electroforesis. Todos los ADN circulares que se producen de forma natural son subenrollados, pero el bromuro de etidio que se intercala en el ADN circular puede cambiar la carga, la longitud, así como la superhelicidad de la molécula de ADN, por lo que su presencia durante la electroforesis puede afectar a su movimiento en el gel. El aumento de bromuro de etidio intercalado en el ADN puede cambiarlo de una molécula superenrollada negativamente a una forma totalmente relajada, y luego a una superhélice enrollada positivamente en la máxima intercalación.[9] La electroforesis en gel de agarosa puede utilizarse para resolver ADN circular con diferente topología de superenrollamiento.
Concentración de gel
La concentración del gel determina el tamaño del poro del gel, que afecta a la migración del ADN. La resolución del ADN cambia con el porcentaje de concentración del gel. Aumentar la concentración de agarosa de un gel reduce la velocidad de migración y mejora la separación de moléculas de ADN más pequeñas, mientras que reducir la concentración del gel permite separar moléculas de ADN grandes. Para una electroforesis en gel de agarosa estándar, una concentración de gel del 0,7% proporciona una buena separación o resolución de fragmentos grandes de ADN de 5-10 kb (kilo-base pair kb o kbp), mientras que una concentración de gel del 2% proporciona una buena resolución para fragmentos pequeños de 0,2-1 kb. Se puede utilizar una concentración de gel de hasta el 3% para separar fragmentos muy pequeños, pero un gel de poliacrilamida vertical sería más apropiado para resolver fragmentos pequeños. Sin embargo, los geles de alta concentración requieren tiempos de ejecución más largos (a veces días) y los geles de alto porcentaje suelen ser quebradizos y pueden no fraguar uniformemente. Los geles de agarosa de alto porcentaje deben realizarse con PFGE o FIGE. Los geles de bajo porcentaje (0,1-0,2%) son frágiles y pueden romperse. Los geles al 1% son comunes para muchas aplicaciones.[10]
Campo de aplicación
A voltajes bajos, la velocidad de migración del ADN es proporcional al voltaje aplicado, es decir, cuanto mayor es el voltaje, más rápido se mueve el ADN. Sin embargo, al aumentar la intensidad del campo eléctrico, la movilidad de los fragmentos de ADN de alto peso molecular aumenta de forma diferencial, y el rango efectivo de separación disminuye, por lo que la resolución es menor a alto voltaje. Para una resolución óptima de ADN de más de 2 kb (kilo-base pair kb o kbp) de tamaño en electroforesis en gel estándar, se recomiendan de 5 a 8 V/cm.[6] El voltaje también está limitado por el hecho de que calienta el gel y puede hacer que éste se derrita si se hace funcionar a alto voltaje durante un periodo prolongado, especialmente en el caso del gel de agarosa de bajo punto de fusión.
Sin embargo, la movilidad del ADN puede cambiar en un campo inestable. En un campo que se invierte periódicamente, la movilidad del ADN de un tamaño determinado puede disminuir significativamente a una frecuencia de ciclado concreta.[11] Este fenómeno puede dar lugar a una inversión de bandas por la que los fragmentos de ADN más grandes se mueven más rápido que los más pequeños en PFGE.
