Encapsulamiento celular

En 1933 Vincenzo Bisceglie hizo el primer intento para encapsular células en una membrana polimérica. Él demostró que una célula en una estructura polimérica tumoral trasplantada a la cavidad abdominal de un cerdo permanecía viable por un periodo extendido sin ser rechazada por el sistema inmune.^[1]

Treinta y un años después, en 1964, la idea de encapsular células dentro de microcápsulas de membranas poliméricas ultradelgadas para proveer de inmunoprotección a células, fue propuesta por Thomas Chang, quien acuñó el término de «célula artificial» para definir el concepto de bioencapsulación.^[2] Él sugirió que las células artificiales producidas por un método de goteo, no solo protegían a las células encapsuladas sino que también daban una relación de superficie a volumen lo bastante grande para una buena transferencia de oxígeno y nutrientes.^[2] Veintidós años después, esta aproximación fue exitosamente puesta en práctica en modelos con animales pequeños, cuando microcápsulas de algín-polilisina-algín (APA) fueron desarrollados para inmovilizar xenoinjertos de células de islotes pancreáticos.^[3] Este estudio demostró que los islotes microencapsulados e implantados en ratas diabéticas se mantuvieron viables y controlaron los niveles de glucosa por varias semanas. Las pruebas en humanos utilizando células encapsuladas fueron conducidas en 1998.^[4][5][6] Células encapsuladas expresando la enzima citocromo P450 para activar localmente un profármaco antitumoral, fueron utilizadas en cáncer pancreático. Aproximadamente se dobló el tiempo de supervivencia comparado con controles históricos.

Muchas preguntas podrían surgir del porqué son requeridas las técnicas de encapsulamiento celular si existen productos terapéuticos que pueden ser injertados en el sitio. Una razón importante es que las células encapsuladas podrían liberar de manera continua y por mayor tiempo productos terapéuticos en el mismo sitio de la implantación. Otra ventaja de las técnicas de microencapsulación es que permiten cargar células no humanas y genéticamente modificadas dentro de la matriz polimérica, esto cuando la disponibilidad de células de donadores es limitada.^[7] La microencapsulación es una valiosa técnica local, regional y oral para proporcionar productos terapéuticos, ya que puede ser implantada en múltiples tejidos y órganos. Para tratamientos prolongados de transporte de fármacos a los sitios de tratamiento, la implantación de estos, en células artificiales es en cuanto a costos más eficiente en comparación a la administración directa. Por otra parte, la posibilidad de implantar células artificiales con composiciones químicas similares a múltiples pacientes desconsiderando su antígeno leucocitario permitiría de igual manera la reducción de costos.^[7]

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El potencial que tiene el uso de células microencapsuladas para aplicaciones exitosas en la clínica solo se puede realizar si se optimizan varios requerimientos en el desarrollo del proceso, como el uso adecuado de polímeros biocompatibles para la formación de una matriz semipermeable químicamente y mecánicamente estable, la producción de microcápsulas uniformes en tamaño, uso apropiado de policationes inmunocompatibles reticulados al polímero de encapsulación para la estabilización de las cápsulas y la selección de un tipo de célula adecuado dependiendo de la situación.

El uso del mejor biomaterial, dependiendo de la aplicación, es crucial en el desarrollo de un sistema de administración de fármacos en ingeniería de tejidos. El polímero alginato es el de uso más común gracias a su temprano descubrimiento, fácil adquisición y a un bajo costo. Sin embargo, otros materiales como el sulfato de celulosa, colágeno, quitosano y agarosa también se han empleado.

Muchos grupos han estudiado de manera extensiva los polímeros sintéticos y naturales con el propósito de desarrollar los biomateriales más adecuados para la microencapsulación celular.^[8][9] Trabajos extensivos han sido desarrollados con el uso de alginato como el biomaterial más adecuado para el encapsulamiento celular gracias a su abundancia, su excelente bicompatibilidad y propiedades biodegradables. El alginato es un polímero natural que puede ser extraído de algas y bacterias^[10] con numerosas composiciones sobre la base de dónde se obtenga.^[10]

El alginato no está exento de críticas. Muchos investigadores creen que el alginato con alto contenido en -M, puede producir una respuesta inflamatoria.^[11][12] y un crecimiento celular anormal.^[13] Mientras otros han establecido que el alginato con altos contenidos -G provoca un crecimiento excesivo de células^[14][15] y reacciones inflamatorias in vivo comparado con alginatos con niveles -G intermedios.^[16][17] Incluso alginatos ultrapuros pueden contener endotoxinas y polifenoles que pueden comprometer la biocompatibilidad de la microcápsula resultante.^[15][18][19] Se ha demostrado que incluso con procesos de purificación que reduzcan los niveles de endotoxinas y polifenoles en el aliginato, es muy difícil reducir el contenido proteico.^[18] y también el proceso podría producir cambios en el biomaterial.^[19] En consecuencia es esencial que se elaboren procesos efectivos de purificación para así remover todos los contaminantes contenidos en el alginato, antes de utilizarse en aplicaciones clínicas.

Investigadores han sido capaces de desarrollar microcápsulas de alginato con formas alternas de este, con biocompatibilidad mejorada y mayor resistencia a hinchazón osmótica.^[20][21] Otro enfoque para mejorar la biocompatibilidad del material de la membrana es a través de la modificación superficial de la cápsula con el uso de péptidos y moléculas proteicas que controlan la proliferación y el cambio de diferenciación de la célula encapsulada. Un grupo que ha trabajado excesivamente en la unión de la secuencia de aminoácidos Arg-Gly-Asp (RGD) a hidrogeles de aliginato hizo evidente que el comportamiento celular puede ser controlado por la densidad del RGD unido al gel de aliginato. La diferenciación y el crecimiento de las células cargadas puede ser controlado por micropartículas de alginato cargadas con mioblastos y RGD funcionalizados.^[22][23] Otro factor vital que controla el uso de microcápsulas celulares en aplicaciones clínicas es el desarrollo de policationes convenientes, inmunocompatibles, que cubran las perlas altamente porosas de alginato y así estabilizar y proteger a las cápsulas del sistema inmune.^[24] La poli-L-lisina (PLL) es el policatión de mayor uso, pero su poca biocompatibilidad restringe su uso clínico, ya que atrae células inflamatorias, provocando necrosis en las células cargadas.^[25] Estudios han revelado que las cápsulas de alginato-PLL-alginato (APA) tienen poca estabilidad mecánica y por ello poco tiempo de durabilidad. Por ende, se han buscado alternativas al PLL que han demostrado resultados prometedores con poli-L-ornitina^[26] y poli(metileno-co-guanidina) clorohidrato^[27] al fabricar microcápsulas duraderas con alta y controlable fuerza mecánica para el encapsulamiento celular.

Muchos grupos también han investigado el uso de quitosano que es un policatión de origen natural y puede ser un reemplazo potencial del PLL para producir microcápsulas de alginato-quitosano (AC, por sus siglas en inglés) para aplicaciones de distribución celular^[28][29] No obstante, otros estudios muestran a la membrana de AC con una estabilidad, nuevamente, limitada^[30][31] y un grupo demostró que las modificaciones de las microcápsulas de alginato-quitosano con genipina, un glucósido iridoide encontrado en frutas de gardenia para formar microcápsulas de genipina reticulado alginato-quitosano (GCAC) puede aumentar su estabilidad.^[30]

El colágeno es un componente proteico que brinda soporte a tejidos como la piel, los cartílagos, huesos, vasos sanguíneos y ligamentos, y por lo tanto es considerado una plataforma de modelo o una matriz para la ingeniería de cultivo, debido a sus propiedades biocompatibles, biodegradables y su habilidad para promover la unión de células.^[32] Esta habilidad permite que el quitosano controle la distribución de células hacía el interior de un sistema polimérico. En consecuencia, el colágeno de tipo I, obtenido de tejidos animales es comercializado de forma exitosa como un biomaterial de la ingeniería tisular con múltiples aplicaciones.^[33] El colágeno también ha sido utilizado en la reparación de nervios^[34] e ingeniería vesicular.^[27] La inmunogenicidad ha limitado su uso. La gelatina fue considerada para sustituirle por tal razón.^[35]

La gelatina es elaborada por la desnaturalización del colágeno, sus propiedades de ser biodegradable, biocompatible, sin inmunogenicidad en ambientes fisiológicos y ser fácilmente procesable hacen de este polímero una buena opción para aplicaciones de ingeniería de tejidos.^[36] En este ámbito es usada para la piel, huesos y cartílagos y, comercialmente, para reemplazos de piel.^[37]

El quitosano es un polisacárido compuesto con uniones β-(1-4) de D-glucosamina (unidad deacetiliada) y N-acetil-D-glucosamina (unidad acetilada) distribuidas de forma aleatoria. Proviene de la N-deacetilación de la quitina y ha sido utilizada para diversas aplicaciones, por ejemplo, la administración de fármacos,^[38] implantes de relleno^[39] y para cobertura de heridas.^[40] Sin embargo, un inconveniente de este polímero es sus débiles propiedades mecánicas, por ello es combinado con otros polímeros como el colágeno, que presenta mayor fuerza mecánica para aplicaciones de encapsulación celular.^[41]

La agarosa es un polisacárido derivado de algas marinas usado para nanoencapsulación de células y la suspensión célula/agarosa,^[42] puede ser modificada para formar microperlas al reducir la temperatura en el momento de preparación.^[43] No obstante, un inconveniente surge al existir la probabilidad de protrusión celular a través de la pared polimérica matricial, después de la formación de las cápsulas.

El sulfato de celulosa proviene del algodón, después de ser procesada de manera apropiada, puede ser utilizada como una base biocompatible en donde suspender células. Cuando el sulfato de celulosa polianiónica es depositada en una segunda solución policatiónica (por ejemplo pDADMAC), una membrana semipermeable se forma alrededor de las células suspendidas, siendo resultado de la gelación de los dos poliiones. Las líneas celulares de mamíferos y bacterias permanecen siendo viables y continúan su replicación dentro de las cápsulas, para así llenarla. A diferencia de otros materiales de encapsulación, pueden ser usados para el crecimiento de células y actuar como un biorreactor de proporciones minúsculas. La naturaleza biocompatible del material se resaltó mediante la observación durante estudios usando las propias cápsulas rellenas para implantación y también para aislar material de la cápsula.^[44] Las cápsulas formadas por sulfato de celulosa han sido usadas exitosamente, demostrando su seguridad y eficacia, en ensayos clínicos y preclínicos tanto en humanos, como en animales, principalmente como un tratamiento contra el cáncer, pero también para explorar su posible uso en terapia de genes o de anticuerpos.^{[4][45][46][47][48]} Usando el sulfato de celulosa se ha podido diseñar encapsulamiento celular como producto farmacéutico a gran escala y cumplir con las normas de correcta fabricación (NCF). Esto lo logró la compañía Austrianova en 2007.^[49]

El uso de un biomaterial ideal de alta calidad, dentro de sus propiedades biocompatibles intrínsecas, es el factor crucial que impera en la eficiencia a largo plazo de esta tecnología. Un biomaterial ideal para la encapsulación celular debe de ser totalmente biocompatible, no debe de activar una respuesta inmune en el huésped y no debe de interferir en la homeostasis de la célula, de tal manera que se asegure la alta viabilidad de las células.^[50] Sin embargo, una de las mayores limitantes, ha sido la falta de habilidad de reproducir los diferentes biomateriales y los requerimientos para obtener un mejor entendimiento de la química y biofuncionalidad de los biomateriales y los sistemas de microencapsulación.^[42] Muchos estudios demuestran que modificaciones en la superficie de estas células, que contienen micropartículas ayuda al control y diferenciación celular^[42][51] de las células encapsuladas.^[52]

Un estudio propone el uso del potencial zeta, el cual mide la carga eléctrica de una microcápsula, como un medio para predecir la reacción de interferencia entre la microcápsula y el tejido circundante y a su vez la biocompatibilidad del sistema de suministro.^[53]

Un criterio fundamental que debe establecerse cuando se está desarrollando cualquier dispositivo con un membrana semipermeables, es el de ajustar la permeabilidad en los parámetros de entrada y salida de moléculas.^[54][55] Es indispensable que la microcápsula celular sea diseñada con un grosor uniforme y que se pueda tener control sobre la proporción en la que entra una molécula necesaria para la viabilidad celular y la proporción de los productos terapéuticos y deshechos que salen de la membrana. En mente hay que considerar también que la inmunoprotección de la célula cargadas es un factor clave cuando se está trabajando con la permeabilidad de la membrana de encapsulación, ya que no solo a las células del sistema inmune se les debe impedir la entrada a la microcápsula, sino también a anticuerpos y a citocinas, esto depende del tamaño del poro de la biomembrana.^[55]

Se ha demostrado que como diferentes tipos de células tienen diferentes requerimientos metabólicos, la permeabilidad de la membrana debe de ser optimizada conforme al tipo de célula que se encuentra encapsulada.^[56] Muchos grupos se han dedicado al estudio de la permeabilidad de la membrana de la microcápsula celular,^[51][52] y aunque el rol de la permeabilidad de ciertos elementos esenciales como el oxígeno se ha demostrado,^[57] aún se tiene que establecer los requerimientos de cada tipo celular conforme a la permeabilidad.

Es esencial que las microcápsulas tengan una fuerza de membrana adecuada (estabilidad mecánica) para poder soportar tanto el estrés físico y el osmótico, por ejemplo, cuando hay intercambio de nutrientes o productos de deshecho celular. Las microcápsulas deben tener la fuerza suficiente y no romperse durante la implantación, porque podrían provocar que el sistema inmune las rechace.^[55] Por ejemplo, en caso de un xenotrasplante, se necesitaría una membrana más estable y gruesa en comparación con un alotrasplante. También, cuando se estaba investigando el potencial del uso de microcápsulas APA cargadas con un cepa sobreactiva de hidrolasa de sales biliares (BSH, por sus siglas en inglés) de Lactobacillus plantarum con 80 células, en estimulación con el modelo del tracto gastrointestinal humano para aplicarlas de forma oral, se evaluó la forma y la integridad mecánica del las microcápsulas. Como resultado las microcáspulas APA podrían potencialmente usadas para este método de transporte de células bacterianas vivas.^[58] No obstante, investigaciones posteriores evidenciaron que las microcápsulas GCAC tenían mayor estabilidad mecánica que las APA para ser suministradas de forma oral.^[59] Martoni et al. estuvieron experimentando con cápsulas llenas de bacterias suministradas oralmente, que podrían ayudar a reducir el nivel de colesterol sérico. Las cápsulas fueron bombeadas a través de vesículas que simulaban el tracto gastrointesitinal humano, para determinar que tan bien podrían sobrevivir en el cuerpo. La investigación sobre las propiedades mecánicas de los biomateriales que podrían ser utilizados para la microencapsulación celular es necesaria, para así poder determinar la durabilidad de estas durante su producción y especialmente para aplicaciones in vivo, donde la constante liberación de productos es necesaria por un periodo largo de tiempo.

El diámetro de las microcápsulas es un importante factor que influye tanto en como el sistema inmune responde a la microcápsula celular como también con la masa de transporte a través de la membrana de la cápsula. Algunos estudios demuestran que la respuesta celular es mucho menor con cápsulas pequeñas que con las de mayor tamaño^[60] y en general el diámetro de las células cargadas en las microcápsulas debe de estar entre 300-400 µm para así permitir la efectiva difusión a través de la membrana semipermeable.^[61][62]

La elección del tipo de célula para esta técnica depende de la aplicación deseada de la microcápsula celular. Las células pueden provenir del mismo paciente (autotrasplante, células autógenas), de otro donador (células alogénicas) o de otra especie (células xenogénicas).^[63] El uso de células autógenas en la terapia de microencapsulación es limitado por la disponibilidad de las células y, aunque las células xenogénicas son fáciles de adquirir, conllevan mayor peligro de contraer virus, especialmente contagiar de retrovirus endógenos porcinos al paciente, por lo cual su uso en aplicaciones clínicas es restringido,^[64] y después de debatirlo, muchos grupos concordaron que los estudios deberían incluir el uso de células alogénicas en vez de las xenogénicas.^[65] Dependiendo de la aplicación, estas células podrían ser modificadas genéticamente para expresar cualquier proteína necesitada.^[66] Sin embargo, suficiente experimentación se debe llevar a cabo para validar la estabilidad y seguridad en la expresión génica, antes de hacer uso de este tipo de células. Esta tecnología no ha sido probada en ensayos clínicos debido a la alta inmunogenicidad de las células contenidas en la cápsula. Estas secretan citocinas y producen reacciones de inflamación en el lugar de implantación, provocando el decrecimiento en la viabilidad de las células encapsuladas.^[15][67] Un acercamiento prometedor que está siendo estudiado, es el de administrar fármacos antiinflamatorios, para así reducir el riesgo de una respuesta inmune contra las microcápsulas.^[68][69] Otra aproximación se enfoca en la investigación extensiva en el uso de células madre como células madre mesenquimales para una microencapsulación de larga duración y aplicaciones en terapia celular, con la esperanza de reducir la respuesta inmune sobre el paciente después de la implantación.^[70] Otro problema que involucra la larga viabilidad de las células microencapsuladas, es el uso de líneas celulares de rápida proliferación, que eventualmente llenan todo el sistema y encaminan a la poca eficiencia en la difusión a través de la membrana semipermeable de las cápsulas.^[66] Una solución sería el uso de tipos de células como los mioblastos, que no proliferan después del procedimiento de encapsulación.