Pichia pastoris

En biología molecular estándar, el organismo más usado para la producción de proteínas a partir de ADN recombinante es la bacteria Escherichia coli. Su elección está basada en su capacidad de crecimiento muy rápido, un buen rendimiento proteico y mínimos requerimientos de elementos nutritivos. La producción en E. coli es generalmente más rápida que la de P. pastoris por varias razones.

Las células de E. coli productivas pueden conservarse congeladas y pueden ser descongeladas poco antes del uso, al contrario que P. pastoris, que necesita de varias generaciones antes de su uso. Los rendimientos en expresión de Pichia varían extensamente con los clones seleccionados, por lo cual es necesario efectuar una selección a partir de un gran número de clones antes de lograr seleccionar un buen productor.

El proceso adecuado para obtener una inducción óptima en Pichia lleva generalmente del orden de varios días, mientras que E. coli necesita sólo de pocas horas para alcanzar las condiciones óptimas de rendimiento. Lo que hace, en cambio, Pichia preferible frente a E. coli es su capacidad de glicosilar las proteínas y generar puentes disulfuro.^[5] Esto significa que en los casos en los cuales son necesarios bisulfitos, la bacteria podría producir proteínas con organización tridimensional incorrecta, es decir normalmente inactivas o insolubles.^[6]

La conocida Saccharomyces cerevisiae (levadura de panadería) es también utilizable como sistema de expresión, con una serie de ventajas frente a análogos de E. coli, análogas a lo visto para Pichia. En cambio Pichia está dotada de dos peculiaridades importantes frente a Saccharomyces cerevisiae.

En primer lugar, Pichia es un metilótrofo, es decir puede crecer usando metanol como única fuente energética, y puede fácilmente crecer en suspensiones celulares dotadas de una solución de metanol razonablemente concentrado, de manera tal que con ello se elimina la posibilidad de desarrollo de la mayor parte de otros microbios, manteniendo bajos los costos de comienzo y de mantenimiento.

En segundo lugar, Pichia crece con densidades celulares muy elevadas, para las cuales en condiciones ideales está en grado de multiplicarse al punto de rendir la solución densa cuanto una especie de con la. Ya que la rendición proteica de la expresión en un microbio es alrededor igual al producto entre la cantidad de proteína por célula y el número de células, Pichia resulta ser de gran importancia cuando son necesarias producciones de elevadas cantidades de proteína sin equipo instrumental demasiado caro.

Comparada con otros sistemas de expresión, como por ejemplo las células S2 de Drosophila melanogaster o las células de ovario de Hámster chino, Pichia generalmente proporciona mejores rendimientos. Sin embargo, estas líneas celulares de organismos multicelulares requieren siempre un sustrato complejo, que incluye aminoácidos, vitaminas y factores de crecimiento. El uso de estos sustratos aumenta considerablemente los costos de producción de proteínas recombinantes mediante ellos. Como Pichia es capaz de crecer en sustratos con sólo una fuente de carbono y una de nitrógeno, es adecuada para aplicaciones con marcado isotópico (por ejemplo, Espectroscopia de resonancia magnética nuclear de proteínas).

En cambio, muchas proteínas requieren la actividad de una chaperonina para conseguir una organización estructural correcta, y Pichia está desprovista de esta chaperonina. En 2006 un grupo de investigación logró crear una cepa capaz de producir eritropoietina en su forma glicosilada.^[7] Este resultado fue alcanzado intercambiando los enzimas responsables de la glicosilación de tipo fúngico por otros de mamífero. De ese modo, la vía de glicosilación alterada ha permitido a la proteína ser completamente funcional.

Otra ventaja de Pichia pastoris es su similitud con la más conocida Saccharomyces cerevisiae. Estas dos levaduras (Pichia y Saccharomyces) tienen condiciones de crecimiento muy parecidos, así como tolerancias nutritivas similares, por lo cual el cultivo de Pichia pastoris puede ser realizado fácilmente en laboratorios también sin especialistas o equipamientos específicos.

El genoma de la cepa GS115 de Pichia pastoris fue completamente secuenciado en 2009 por el Flanders Institute for Biotechnology (VIB) y la Universidad de Gante (Ghent University - UGent) y publicado en la revista Nature Biotechnology.^[8] La secuencia del genoma y la anotación funcional de los genes pueden visualizarse a través el sistema ORCAE.