Amplification isotherme médiée par les boucles
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L'amplification isotherme médiée par les boucles (LAMP) est une technique à tube unique pour l'amplification de l'ADN[1],[2] et une alternative peu coûteuse pour détecter certaines maladies. L'amplification isotherme médiée par boucle de transcription inverse (RT-LAMP) combine la LAMP avec une étape de transcription inverse pour permettre la détection de l'ARN.
LAMP est une technique d'amplification d'acide nucléique isotherme. Contrairement à la technologie d'amplification en chaîne par polymérase (PCR), dans laquelle la réaction est effectuée avec une série d'étapes ou de cycles de température alternés, l'amplification isotherme (c'est-à-dire à température constante) ne nécessite pas de thermocycleur.
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Dans LAMP, la séquence cible est amplifiée à une température constante entre 60 et 65 °C en utilisant deux ou trois ensembles d'amorces et une polymérase avec une activité de déplacement de brin élevée en plus d'une activité de réplication. Généralement, 4 amorces différentes sont utilisées pour amplifier 6 régions distinctes sur le gène cible, ce qui augmente la spécificité : deux amorces externe (F3 et B3) et deux amorces internes doubles (FIB et BIP). Une paire supplémentaire d'« amorces en boucle » peut encore accélérer la réaction[4]. Pour chaque action de l’ADN polymérase on a un déplacement de brin et la formation de boucles du début à la fin de l’amplification. On obtient des molécules en zigzag de plus en plus longues au fur et à mesure des cycles de la polymérase. Les molécules obtenues ont alors des séquences différentes de celles de départ mais une grande quantité d’ADN est amplifiée à partir de peu de matériel.
Quand un nucléotide est ajouté au cours de l’amplification, on a libération d’un pyrophosphate de magnésium. On considère que la quantité dégagée est tellement importante que les pyrophosphates précipitent et créent un trouble visible à l’oeil nu dans le tube contenant l’échantillon. La quantité d'ADN produite dans LAMP est considérablement plus élevée que l'amplification basée sur la PCR, en effet, en 30 à 60 min, on a une amplification d’un facteur 10, donc très importante.
Le produit d'amplification peut être détecté par photométrie, mesurant la turbidité provoquée par le précipité de pyrophosphate de magnésium dans la solution comme sous-produit de l'amplification[5]. On peut ainsi obtenir une visualisation aisée à l'œil nu ou via de simples approches de détection photométrique pour de petits volumes. La réaction peut être suivie en temps réel par mesure de la turbidité[6] ou par fluorescence en utilisant des colorants intercalants tels que SYTO 9[7]. Les colorants tels que le vert SYBR peuvent être utilisés comme indicateur coloré il peut donc être vu à l'œil nu sans avoir besoin d'équipement coûteux, ou une réponse qui peut être mesurée avec plus de précision par l'instrumentation.
La méthode LAMP peut également être quantitative, car les molécules de colorant intercalent ou marquent directement l'ADN et peuvent à leur tour être corrélées avec le nombre de copies initialement présentes. La détection de l'amplification de l'ADN dans le tube est possible en utilisant de la calcine chargée de manganèse qui commence à émettre de la lumière (fluorescence) lors de la complexation du manganèse par le pyrophosphate durant la synthèse in vitro de l'ADN[8]. De plus, la détection visuelle des amplicons LAMP par l'œil nu était basée sur leur capacité à s'hybrider avec l'ADN-ss lié à l'or complémentaire et ainsi empêcher le changement de couleur rouge normal à violet-bleu qui se produirait autrement par une agrégation induite par le sel de les particules d'or. Ainsi, une méthode LAMP combinée à une détection d'amplicon par AuNP présente des avantages par rapport aux autres méthodes précédentes en termes de temps de test réduit, de confirmation d'amplicon par hybridation et d'utilisation d'un équipement plus simple (c'est-à-dire pas besoin d'un thermocycleur, d'un équipement d'électrophorèse ou d'un trans-illuminateur UV[9].
