SIRIUS

SIRIUS: Bestimmung der Summenformel

SIRIUS ist der Name der Software, aber (aus historischen Gründen) auch der Name für die Bestimmung der Summenformel. Die Summenformel bezieht sich auf die elementare Zusammensetzung des Moleküls. Die Masse eines Moleküls reicht allein nicht aus, um die richtige Summenformel zu bestimmen.^[13] Selbst bei sehr hoher Massengenauigkeit können viele Summenformeln, die im Massenspektrometer gemessene Masse erklären, insbesondere in höheren Massenbereichen. In SIRIUS wird die Summenformel durch Isotopenmusteranalyse der MS1-Daten und Fragmentierungsbaumberechnung anhand der MS2-Daten bestimmt. Der Score eines Summenformelkandidaten ist eine Kombination aus Isotopenmusterscore und Fragmentierungsbaumscore.

Um die Summenformel zu bestimmen, berücksichtigt SIRIUS alle möglichen Summenformeln für eine Reihe von Elementen.

ZODIAC: Verbesserte Bestimmung der Summenformel

ZODIAC verbessert das Ranking der Summenformelkandidaten.^[8] Organismen produzieren verwandte Metaboliten, die aus mehreren, aber begrenzten Biosynthesewegen stammen. In einer biologischen Probe oder einer Probe aus einer anderen Gruppe von Derivaten spiegelt sich die Beziehung zwischen den Metaboliten in ihrer strukturellen Ähnlichkeit wider. Diese Ähnlichkeiten spiegeln sich wiederum in gemeinsamen Fragmenten und Verlusten zwischen den Fragmentierungsbäumen wider und können zur Verbesserung der Identifizierung der Molekülformeln der einzelnen Moleküle verwendet werden.

ZODIAC verwendet die X-besten Summenformelkandidaten für jedes Molekül aus SIRIUS, um ein Netzwerk anhand von Ähnlichkeiten zu erstellen, und verwendet Bayessche Statistik, um die Kandidaten neu zu ordnen. Die A-priori-Wahrscheinlichkeiten werden aus der Ähnlichkeit der Fragmentierungsbäume abgeleitet. Die Suche nach einer optimalen Lösung für das resultierende Berechnungsproblem ist NP-schwer, daher wird Gibbs-Sampling verwendet.

ZODIAC steht für ZODIAC: Organic compound Determination by Integral Assignment of elemental Compositions.

CSI:FingerID: Suche in der Strukturdatenbank

CSI:FingerID identifiziert die Struktur eines Moleküls durch Vorhersage seines molekularen Fingerabdrucks und verwendet diesen Fingerabdruck für die Suche in einer Molekülstrukturdatenbank.^[7]

COSMIC: Konfidenz der Identifizierung

COSMIC bewertet die Konfidenz der von CSI:FingerID identifizierten Molekülstrukturen.^[11] Die Idee ist ähnlich zu False Discovery Rates: Alle Moleküle eines großen Datensatzes werden mit CSI:FingerID analysiert. Die jeweils beste Struktur für jedes Molekül wird von COSMIC bewertet und die vertrauenswürdigsten Identifikationen können dann für die weitere Analyse ausgewählt werden. Anders als ZODIAC nimmt COSMIC keine Neuordnung der Ranglisten vor. COSMIC verwirft auch keine der Identifizierungen.

Der von COSMIC verwendete Konfidenzwert kombiniert E-Wert-Schätzung mit einer linearen Support-Vektor-Maschine (SVM) mit erzwungener Direktionalität. Die Kalibrierung der CSI:FingerID-Scores erfolgt anhand von E-Wert-Schätzungen.^[18] Die Generierung von Decoys für kleine Molekülstrukturen ist eine nicht triviale Aufgabe, weshalb die Kandidaten in PubChem hier als Ersatz für Decoys dienen.

Die Score-Verteilung wird als Mischverteilung von Logarithmischen Normalverteilungen modelliert. Die SVM wird eingesetzt, um zu klassifizieren, ob ein Treffer korrekt ist. Das Lernen wird auf eine lineare SVM beschränkt, um das Risiko einer Überanpassung zu verringern. Die Richtungsabhängigkeit der Merkmale wird erzwungen. Dies bedeutet, dass im Voraus entschieden werden muss, ob hohe oder niedrige Werte eines Merkmals das Vertrauen in eine Identifizierung erhöhen sollen. So sollte beispielsweise ein hoher CSI:FingerID-Score eines Treffers das Vertrauen in die Richtigkeit des Treffers erhöhen, aber niemals verringern. Bei einigen Merkmalen müssen mindestens zwei Kandidaten für den Vergleich vorhanden sein, und es werden separate SVMs für einzelne Instanzen trainiert. Die Entscheidungswerte der SVM werden mit Hilfe der Platt-Skalierung auf A-posteriori-Wahrscheinlichkeitsschätzungen abgebildet.^[19] Dieser umfassende Ansatz gewährleistet eine robuste und nuancierte Bewertung der Konfidenz in Molekülidentifizierungen.^[11]

CANOPUS: Vorhersage von Verbindungsklassen

CANOPUS steht für Class Assignment and Ontology Prediction Using mass Spectrometry.^[10] Es sagt Verbindungsklassen auf der Grundlage des molekularen Fingerabdrucks voraus, der von CSI:FingerID vorhergesagt wurde. Dieser Ansatz ist vollkommen datenbankfrei, d. h. er ist nicht einmal auf Moleküle beschränkt, die in Strukturdatenbanken enthalten sind.

CANOPUS verwendet ein Deep Neural Network (DNN), um 2.497 Verbindungsklassen vorherzusagen. Das DNN wurde auf 4,1 Millionen Molekülstrukturen und deren von ClassyFire zugewiesenen Verbindungsklassen trainiert. Für das Training wurden keine MS/MS-Daten verwendet, stattdessen wurden simulierte „realistische“ probabilistische Fingerabdrücke der Trainingsstrukturen verwendet. Das DNN sagt alle Verbindungsklassen gleichzeitig voraus.

Für vollständige biologische Datensätze bietet CANOPUS einen umfassenden Überblick über die in der Probe vorhandenen Verbindungsklassen und ermöglicht Vergleiche zwischen verschiedenen Kohorten auf Ebene der Verbindungsklassen.

MSNovelist: De novo-Strukturvorhersage

MSNovelist ist eine computergestützte Methode zur de novo-Generierung von Strukturen kleiner Moleküle^[12]. Sie wurde entwickelt, um die wesentliche Einschränkung datenbankbasierter Suchmethoden zu beheben, lediglich Verbindungen, die bereits in Referenzstruktur-Datenbanken gespeichert sind, identifizieren zu können. MSNovelist ist besonders relevant für die Analyse neu entdeckter oder in Datenbanken unterrepräsentierter Analytenklassen. Es ist nicht das Ziel, die Suche in Datenbanken generell zu ersetzen. Für unbekannte Verbindungen ist es jedoch wichtig, Kandidatenstrukturen zu generieren, die einen guten Ausgangspunkt für deren Aufklärung bieten.

MSNovelist generiert neue Molekülstrukturen auf der Grundlage der Molekülformel (identifiziert durch SIRIUS) und des molekularen Fingerabdrucks (vorhergesagt durch CSI:FingerID) der unbekannten Verbindung. Ein Encoder-Decoder-Modell mit rekurrenten neuronalen Netzen (RNN) wird trainiert, um den eingegebenen Fingerabdruck unter den Einschränkungen der vorhergesagten Molekülformel in eine Struktur zu übersetzen, die als SMILES-Sequenz dargestellt wird. MSNovelist generiert mehrere Kandidatenstrukturen aus dem vorhergesagten molekularen Fingerabdruck. Sobald die Kandidatenstrukturen generiert sind, werden sie mit CSI:FingerID gerankt.

Zusätzliche Funktionen

Über die algorithmischen Kernfunktionen hinaus bietet SIRIUS eine Reihe von Zusatzfunktionen, die den Analyse-Workflow erweiteren.

• LC/MS-Vorverarbeitung: SIRIUS kann chromatographische Features automatisch über mehrere Proben hinweg erkennen und zusammenführen (align), sowie Addukte zuweisen. Die Vorverarbeitung liefert zudem Qualitätsmetriken, die es den Benutzern ermöglichen, Ergebnisse für die nachgeschaltete Analyse zu priorisieren und zu filtern.
• Suche in Referenzspektrendatenbanken: SIRIUS ermöglicht eine schnelle Identitätssuche und eine Analog-Suche in Referenzspektrendatenbanken. Die Identitätssuche gleicht das gemessene Spektrum mit Referenzspektren derselben Precursor-Masse ab. Eine Analog-Suche gleicht das gemessene Spektrum mit Referenzspektren abweichender Precursor-Masse ab. Die Treffer der Referenzspektrendatenbanken dienen als zusätzliche Annotationen neben den Ergebnissen aus der Strukturdatenbanksuche, aber beeinflussen deren Ranking nicht.
• Annotation von Substrukturen: Die Annotation von Substrukturen dient als Visualisierungswerkzeug, um die Verbindung zwischen dem eingegebenen MS/MS-Spektrum, dem vorhergesagten Strukturkandidaten und gegebenenfalls Referenzspektren (sowohl selber als auch abweichender Precursor-Masse) zu veranschaulichen. Diese Funktion basiert auf der kombinatorischen Fragmentierung der Struktur und arbeitet unabhängig vom Scoring-Algorithmus, den CSI:FingerID für die Rangfolge der Strukturkandidaten verwendet.
• Structure Sketcher: Der Structure Sketcher ist eine Komponente für chemische Zeichnungen, die die manuelle Modifikation bestehender Kandidatenstrukturen oder die Erstellung neuer Strukturen ermöglicht. Benutzer können diese manuell definierten Strukturen in die Liste der Kandidaten für die anschließende Analyse integrieren.
• BioTransformer-Integration: SIRIUS integriert BioTransformer 3.0^[20] zur Generierung benutzerdefinierter Datenbanken für Transformationsprodukte.
• Kendrick Mass Defect (KMD) Plots: SIRIUS kann Kendrick Mass Defect (KMD) Plots generieren. Diese Diagramme werden verwendet, um chemisch verwandte Moleküle, wie z. B. homologe Reihen, schnell zu gruppieren, was ihre Identifizierung innerhalb komplexer Probendaten erleichtert.

Beispiele für Anwendungen

• Zunehmende Antibiotikaresistenz ist eine ernsthafte Bedrohung für die öffentliche Gesundheit, die durch Antibiotikarückständen im Abwasser noch verschärft wird. SIRIUS identifiziert die Antibiotika-Abbauprodukte einer vielversprechenden biologischen Lösung zur Entfernung persistenter Antibiotikarückstände aus dem Abwasser durch Pilze.^[23]
• Die weit verbreitete Verwendung von synthetischen Polymeren in Materialien, die mit Lebensmitteln in Kontakt kommen, hat erhebliche Bedenken hinsichtlich der Kunststoffkontamination in Lebensmitteln und Getränken aufgeworfen. Forscher untersuchten mit SIRIUS verdächtige und unerwartete Chemikalien in einer Vielzahl von Spirituosenproben.^[24]
• SIRIUS wird in der Forensik eingesetzt, um die chemischen Veränderungen während der Zersetzung zu analysieren, was zum Verständnis mikrobieller Netzwerke und möglicherweise zur Vorhersage der Zeit seit dem Tod beiträgt.^[25]
• Getrocknete Bluttropfen, sogenanntes Trockenblut, von Neugeborenen sind wichtig für das Neugeborenen-Screening und werden zur Untersuchung möglicher metabolischer Ursachen verschiedener Krankheiten mit Hilfe von nicht-zielgerichteter LC-MS-basierter Metabolomik verwendet. Mit SIRIUS untersuchten die Forscher die Stabilität der Metaboliten in Biobanken mit Trockenblut von Neugeborenen.^[26]
• Marine Mikroorganismen sind eine reiche Quelle bioaktiver Verbindungen mit einzigartigen Strukturen und bemerkenswerter biologischer Aktivität. Dies macht sie zu einer wichtigen Ressource für die Suche nach neuen therapeutischen Wirkstoffen. Die Forscher nutzten SIRIUS, um die Suche auf die vielversprechendsten Mikroorganismen einzugrenzen.^[27]
• Pädiatrisches Asthma stellt aufgrund seiner vielfältigen Erscheinungsformen eine diagnostische Herausforderung dar. Die Atemanalyse könnte die Behandlung von allergischem Asthma bei Kindern entscheidend verändern. Durch die Identifizierung einzigartiger Stoffwechselsignaturen im Atem mit Hilfe von SIRIUS haben Forscher einen Ansatz für die Diagnose von Kindern mit allergischem Asthma entwickelt.^[28]
• Thiacloprid ist ein weit verbreitetes Neonicotinoid-Insektizid der ersten Generation. Seine Langlebigkeit in der Umwelt und seine möglichen schädlichen Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit geben Anlass zu großer Besorgnis. Die Klärung des Verunreinigungsprofils von Pestiziden ist entscheidend für die Bewertung ihrer Umweltauswirkungen und potenziellen Risiken sowie für die Festlegung akzeptabler Grenzwerte für Verunreinigungen. Mit Hilfe von SIRIUS haben Forscher einen Ansatz zur Identifizierung strukturell verwandter Verunreinigungen in Pestiziden entwickelt.^[29]
• Unter bestimmten Bedingungen können zwei Bakterienarten gemeinsam in einem Zwei-Spezies-Biofilm wachsen. Die Zusammenarbeit von P. aeruginosa und S. aureus bei Mukoviszidose führt zu einer erhöhten Schwere der Erkrankung. Mit Hilfe von SIRIUS identifizierten die Forscher einen Metaboliten, der mit der verstärkten Pathogenese dieses Zwei-Spezies-Biofilms bei Mukoviszidose in Zusammenhang stehen könnte.^[30]
• Unsere Haut beherbergt eine vielfältige Gemeinschaft von Mikroorganismen, die als Hautmikrobiota bezeichnet wird. Mit Hilfe von SIRIUS identifizierten Forscher Veränderungen im Metabolom der Haut, die ausgeprägter sind als Veränderungen in der mikrobiellen Zusammensetzung.^[31]

Grenzen der Messmethode

Massenspektren allein liefern nicht genügend Informationen, um jedes Molekül eindeutig zu identifizieren. Manche Moleküle erzeugen fast identische Spektren – sie ähneln sich sogar mehr als ein und dasselbe Molekül, das mit zwei verschiedenen Geräten gemessen wird.^[32] Für eine eindeutige Identifizierung sind umfangreiche Folgeexperimente erforderlich.

Es ist daher unmöglich, eine Molekülstruktur allein auf der Basis eines Massenspektrums immer korrekt zu identifizieren. Daher können CSI:FingerID und andere Suchmethoden in Strukturdatenbanken nicht garantieren, dass die richtige Molekülstruktur als erster Treffer gefunden wird. Aus diesem Grund ist es wichtig, die richtige Struktur aus einer umfangreichen Liste von Kandidaten sehr hoch zu ranken und eine Konfidenz für den Treffer zu erhalten.

Grenzen von Strukturdatenbanken

Strukturdatenbanken sind um Größenordnungen größer als Referenzspektren-Datenbanken, aber immer noch unvollständig.^[33] Es versteht sich von selbst, dass nicht jedes existierende Biomolekül in Strukturdatenbanken enthalten ist oder sein wird.

Für diese Moleküle bietet SIRIUS mehrere Lösungen an:

• SIRIUS kann in Datenbanken mit hypothetischen Strukturen suchen.^[11] Dies kann z. B. für die Suche nach Derivaten interessant sein.
• Der vorhergesagte molekulare Fingerabdruck liefert strukturelle Informationen, z. B. über Substrukturen.^[7]
• CANOPUS sagt die Verbindungsklassen eines Moleküls voraus, ohne in einer Datenbank zu suchen.^[10]
• MSNovelist generiert aus dem vorhergesagten molekularen Fingerabdruck de novo Kandidatenstrukturen.^[12]