Proteína A

Organización general

Las proteínas de superficie y los pili en la cara externa de la pared bacteriana, resultan elementos clave en el momento de la adhesión de patógenos bacterianos a los tejidos del huésped. La razón detrás de tal importancia radica en la capacidad provista por dichas proteínas de establecer interacciones específicas receptor-ligando con los factores tisulares. Estas proteínas son conocidas como las adhesinas bacterianas y algunas, como la correspondiente a la proteína A, permiten la interacción directa con moléculas de la matriz extracelular del huésped.^[14]

La estructura cuaternaria de la proteína A está compuesta por un único monómero. Estas proteínas están localizadas en la superficie de la bacteria, dispuestas de forma ordenada y orientada hacia el exterior, de tal forma que los dominios de unión a immunoglobulinas quedan expuestos hacia el medio extracelular. Su distribución está lejos de ser uniforme: se concentran en focos discretos localizados alrededor de la bacteria, obteniendo así, una cobertura parcial de su superficie. ^[15]

Motivo LPXTG3

El motivo LPXTG3 se trata de una región de la proteína A cuya función consiste en posibilitar el anclaje de la proteína en la pared bacteriana. Esta región se sitúa próxima al extremo C-terminal de la cadena polipeptídica.^[16] Este anclaje es un proceso previo esencial para que la proteína A pueda llevar a cabo su función.^[17]

Las bacterias Gram-positivas, como en el caso del Staphylococcus aureus, presentan un mecanismo de transpeptidación que únicamente permite que proteínas que contengan una señal de clasificación C-terminal con un motivo LPXTG conservado sean ancladas a la envoltura que constituye la pared bacteriana. Este proceso es desarrollado gracias a la proteína transmembrana de la bacteria Staphylococcus aureus denominada sortasa A. Esta tiene la función de producir una escisión de la cadena polipeptídica entre la treonina y la glicina presente en el motivo LPXTG, generando una enzima aciclada entre el grupo tiol de la cisteína y el grupo carboxilo de la treonina.^[18] Esto permite que, posteriormente, se catalice la formación de un enlace amida entre el grupo carboxilo de la treonina y el grupo amino de los puentes cruzados de la pentaglicina, peptidoglicano constituyente de la pared bacteriana.^[19] Así, de esta forma, se consigue un exitoso anclaje de la proteína a la pared bacteriana, quedando, esta, orientada hacia el exterior.^[20]

Dominio X

El dominio X se trata de una región polimórfica cuya composición se fundamenta en la repetición en tándem de ocho unidades de aminoácidos. Tras la realización de un estudio llevado a cabo por el Departamento de Higiene de la Facultad de Medicina de la Universidad Médica de Sapporo, Japón, se determinó que existen 10 tipos diferentes de regiones X para la proteína A, caracterizados por la repetición de 4 a 13 aminoácidos en su secuencia proteica, en un total de 293 aislamientos clínicos. También, dependiendo de la cepa de S. aureus, esta tendrá con mayor probabilidad un tipo u otro de región X.^[21] En otro estudio, se determinó la secuencia primaria de aminoácidos de la región de dos cepas diferentes: la cepa 8325-4 y la Cowan I.

• Cepa Cowan I: Determinada parcialmente mediante un proceso de degradación de Edman.
• Cepa 8325-4: Analizada en su totalidad mediante la secuenciación de nucleótidos del gen correspondiente a la región X. Gracias a ello, se descubrió que el dominio consta de dos subdominios con diferencias estructurales entre sí. El primero se trata de 12 repeticiones de un octapéptido, mientras que el segundo es un dominio C-terminal con una única secuencia.

Si la región X de ambas cepas es comparada, se observa una elevada homología entre ellas y, de forma interna, entre las estructuras del octapéptido: seis de los ocho aminoácidos son idénticos y los otros 2 sufren cambios siguiendo un patrón altamente regular.^[22]

Al igual que en el motivo LPXTG3, esta región también tiene un papel importante en la unión de la proteína A a los peptidoglicanos que constituyen la pared bacteriana.^[22]

Dominios A-E

Estos dominios son zonas clave de la proteína A en el momento de facilitar la unión de esta a las regiones Fab y Fc presentes en las inmunoglobulinas humanas.^[23] Conforman la porción extracelular de la proteína A y cada dominio posee una estructura concreta que favorece la unión de la proteína a las IgG.^[24]

Dominio B

Región localizada en la zona intermedia de la cadena polipeptídica. Su secuencia de aminoácidos es la siguiente: ADNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK.^[25]

Dominio E

Región localizada en la zona inicial de la cadena polipeptídica. Su secuencia de aminoácidos es la siguiente: AQHDEAQQNAFYQVLNMPNLNADQRNGFIQSLKDDPSQSANVLGEAQKLNDSQAPK.^[25]

Así pues, a lo largo de la cadena polipeptídica, los dominios se localizan en el siguiente orden, siguiendo el sentido N-terminal → C-terminal: N’→ E → D → A → B → C → C’ ^[25]

Oritentación y disposición superficial

La proteína A estafilocócica se trata de un factor de virulencia clave anclado a la pared bacteriana. Para poder llevar a cabo correctamente su función, es esencial que esta se encuentre correctamente anclada y orientada en la pared bacteriana. Estudios recientes han demostrado que el proceso de distribución de esta proteína se encuentra regulado por un péptido señal YSIR/GXXS, el cual tiene la función de promover la colocación de la proteína en posición transmembrana en la zona media de la célula. No obstante, cabe destacar que los procesos encargados de la colocación no se encuentran estudiados en profundidad y aún se desconoce parte de dicho proceso.^[26]

Sistema de componentes ArlS y ArlR

El patógeno humano Staphylococcus Aureus es una bacteria gram-positiva muy versátil, capaz de detectar y adaptarse a una elevada diversidad de ambientes dentro del huésped humano. En gran parte, la principal causa de tal característica reside en los 16 sistemas reguladores de dos componentes que presenta.^[28]

El sistema de componentes ArlS y ArlR modifica la actividad de la serina proteasa extracelular, haciendo que, con elevada probabilidad, este sistema se encuentre implicado en la regulación de los factores de virulencia del patógeno humano Staphylococcus Aureus.^[29] Además, se ha demostrado múltiples veces como este sistema afecta a numerosos procesos celulares de la bacteria, como la formación de biopelículas o la síntesis de la cápsula, entre muchos otros. Los detalles moleculares han permanecido desconocidos hasta la actualidad: un estudio realizado recientemente ha permitido dar a conocer más información acerca de estos procesos. Este ha consistido en la secuenciación del ARN, permitiendo, así, la detección del regulón ArlRS. En el mismo se ha encontrado un solapamiento del 70% con el del regulador de expresión génica global MgrA, también de la proteína A. Gracias a este estudio se ha demostrado que el regulón ArlR activa directamente la expresión de mgrA, regulando, así, la expresión del gen spa. Además, también ha demostrado que el gen ArlS posee actividad quinasa hacia ArlR in vitro, aún presentar una cinética más lenta que otras histidina-quinasas similares.^[28]

Sistema AGR

En los organismo estafilococos, su capacidad de detectar la densidad celular bacteriana o cuórum y de ser capaces de responder con adaptaciones genéticas, se debe generalmente a un sistema principal denominado regulador génico accesorio (AGR). La señal extracelular de AGR consiste en un péptido modificado postraduccionalmente que contiene una estructura de tiolactona. Dependiendo de la densidad celular bacteriana, el comportamiento del gen será de un tipo u otro:

• En caso de haber una elevada densidad celular bacteriana, este produce una disminución de la expresión de factores encargados de la colonización bacteriana y un aumento de la expresión de genes codificadores de exoenzimas y toxinas degradativas.
• De forma contraria, en caso de haber una baja densidad celular bacteriana, se produce el efecto contrario, para, de esta forma, poder permitir el crecimiento de la colonia bacteriana.^[30]

Este sistema permite que el gen spa, al igual que muchas de las proteínas de unión a la matriz extracelular, únicamente se exprese durante la fase exponencial de crecimiento de la colonia bacteriana. A partir de aquí, se va regulando negativamente a nivel transcripcional.^[31]

Funcionamiento del sistema AGR

La señal AIP se origina a partir del precursor AGR D, que es procesado y exportado por la proteína AGR B. Cuando la concentración de AIP alcanza un nivel umbral, esta molécula activa el sistema de dos componentes AGR C-AGR A. Una vez que AGR A se fosforila, estimula la transcripción desde el promotor P2, generando así un mecanismo de autorregulación positiva y logrando que, así, se transcriban los operones AGR. Una propiedad destacada del sistema AGR es su especificidad de grupo el cual provoca una inhibición cruzada. Esto significa que el sistema AGR puede bloquear su propia actividad en cepas pertenecientes a otros grupos de especificidad o incluso en otras especies. Además, la mayoría de los genes diana están regulados por RNAIII, cuya transcripción se incrementa gracias a AGR A, a través del promotor P3. Este RNAIII también contiene el gen de la δ-toxina (hld). El RNAIII regula los genes diana uniéndose por complementariedad de bases a las regiones 5'UTR de los ARNm, lo que normalmente inhibe su traducción. Este mecanismo se utiliza para reprimir directamente los genes inhibidos por AGR, como el de la proteína A, mientras que la inhibición de la traducción del represor Rot provoca la activación de la transcripción de muchas toxinas clásicas controladas por AGR, como la α-toxina. Finalmente, AGR A también estimula la transcripción de los operones psm α y psm β, que codifican los péptidos PSM, mediante un mecanismo de regulación independiente del RNAIII.^[30]

Este sistema, al igual que el sistema lytRS, es sensible a las condiciones ambientales, lo que permite que el gen spa lleve a cabo su función únicamente expuesto a determinadas condiciones del entorno, tal y como ya ha sido comentado con anterioridad.^[32]

Sistema sarA

Staphyloccus aureus produce una familia de proteínas con afinidad por el ADN que regulan la expresión de factores de virulencia, entre las cuales encontramos el sistema AGR explicado en el anterior apartado. La más estudiada hasta el momento es la proteína SarA, perteneciente al sistema regulador accesorio estafilocócico, que se une a los ácidos nucleicos.

Staphylococcus aureus es conocido por ser un patógeno oportunista, sobre todo en el contexto de las infecciones hospitalarias. Este causa infecciones nosocomiales adquiridas en la comunidad y con elevadas tasas de morbilidad y mortalidad. Su éxito se debe a la gran variedad de proteínas reguladoras que posee, entre ellas la familia de proteínas SarA, las cuales le permiten adaptarse a distintos microambientes.^[33]

Topología del ADN

El ADN bacteriano se mantiene en un estado de superenrollamiento negativo, una condición que facilita procesos esenciales como la recombinación, la replicación, la transcripción y la transposición del material genético. El grado de superenrollamiento depende de la energía celular disponible, por lo que puede variar rápidamente en función de las condiciones ambientales o nutricionales.

Varios estudios independientes han demostrado que el superenrollamiento del ADN participa en la transmisión de señales ambientales hacia el nucleoide bacteriano. En concreto, se ha comprobado que factores como la osmoralidad o mutaciones en el gen gyrB142 pueden alterar el nivel de superenrollamiento del ADN, modificando así su estructura y función. La influencia de estos factores sobre el cromosoma bacteriano puede provocar una mayor o menor condensación, aspecto que determina la facilidad de expresión de los genes, entre ellos, el gen spa.^[41]

Factores ambientales que afectan a la topología del ADN:

Osmolaridad

Varios estudios han mostrado que factores como la presencia de NaCl, la sacarosa, un pH alcalino, la glucosa, la temperatura y distintos iones en el entorno pueden producir una modificación de la expresión de los genes de virulencia.^[42][43] En investigaciones previas, se introdujo una fusión transcripcional sspa::lacZ como copia única en el cromosoma de la cepa silvestre RN6390BF.^[44]

Se observó que la presencia de 1M de NaCl reducía de manera marcada la expresión del gen spa: su nivel se vio reducido entre cuatro a siete veces en comparación con las condiciones sin NaCl. Para averiguar si esta represión inducida por NaCl se debe a un efecto general de estrés osmótico o a una acción específica de los iones sodio o cloruro, se analizó cómo afectaban a la transcripción de spa otros osmolitos: un osmolito iónico similar (KCl) y uno no iónico (sacarosa). Tanto la sacarosa (1M) como el KCl (1M) redujeron la expresión de spa en un grado comparable. Esto indica que la inhibición de spa está probablemente relacionada con la respuesta al estrés osmótico, más que con un efecto particular de los iones específicos del NaCl.^[45]

La elevada osmoralidad también modifica el superenrollamiento del ADN plasmídico. Esto se determinó gracias a un análisis realizado sobre el efecto que produce la osmoralidad en la distribución de topoisómeros del plásmido pE194 aislado de RN6390BF.^[46] Las bacterias se cultivaron a 37 °C en medio TSB con los antibióticos adecuados hasta alcanzar una DO₆₀₀ de 2, y posteriormente se extrajo el ADN plasmídico. Como era previsible, los plasmidios obtenidos de células expuestas a condiciones de alta osmolaridad presentaban un mayor número de topoisómeros superenrollados que aquellos obtenidos de cultivos con baja osmolaridad.^[45]

Mutación del gen gyrB142

El superenrollamiento del ADN está controlado por diversas enzimas especializadas. Entre ellas, la ADN girasa es la topoisomerasa bacteriana encargada de introducir superenrollamientos negativos en el ADN, utilizando energía libre procedente de la hidrólisis de ATP. Esta enzima está formada por dos tipos de subunidades, A y B, que juntas constituyen el complejo activo A₂B₂. La subunidad A (GyrA) se ocupa de romper y volver a unir las hebras de ADN mediante su dominio N-terminal, además de participar en las interacciones ADN-proteína a través de su dominio C-terminal. Por otro lado, el dominio N-terminal de la subunidad B alberga la actividad ATPasa. Fármacos como las cumarinas, por ejemplo la novobiocina, actúan inhibiendo esta actividad ATPasa.^[45] En Stpahylococcus Aureus existe un alelo denominado gyrB142 que contiene dos mutaciones: Ile102Ser y Arg144Ile; confiriendo una elevada resistencia a la novobiocina.^[47] Ambas mutaciones se encuentran en el dominio N-terminal de la proteína, responsable de la función ATPasa. El residuo Arg144 de Staphylococcus Aureus ocupa la misma posición que Arg136 en la proteína equivalente de Escherichia coli. Las variantes mutadas Arg136-His, Arg136-Cis y Arg136-Ser de Escherichia coli muestran una reducción variable de la actividad de superenrollamiento, comparadas con la enzima silvestre.^[48] Por tanto, se considera que, al igual que ocurre en Escherichia coli, la presencia del alelo gyrB142 en Staphylococcus Aureus provocaría una relajación del ADN al alterar su actividad ATPasa.^[47]

Al comparar la distribución de topoisómeros obtenida de los plasmidios de la cepa silvestre y de la mutante gyrB142, se observó que la de la cepa silvestre mostraba dos o tres desplazamientos respecto a la del mutante. Esto indica que, en cepas de Staphylococcus Aureus que poseen el alelo gyrB142, se produce una relajación del ADN plasmídico. Además, distintos estudios han demostrado que el alelo gyrB142 provoca un aumento en la expresión del gen que codifica la proteína A, sobre todo durante la fase exponencial del crecimiento bacteriano. Dado que este alelo también causa relajación del ADN, los resultados apoyan la idea de que existe una relación directa entre la relajación del ADN y el incremento de la producción de la proteína A.^[45]

Unión de la proteína A a la región Fc de las IgG

Habitualmente, la opsonización de la IgG es un proceso mediante el cual los anticuerpos marcan al patógeno para su ingesta y destrucción:

1. La región Fab, situada en el extremo variable de la molécula, reconoce de forma altamente específica a los antígenos en la superficie bacteriana, impidiendo la adhesión y entrada del patógeno en las células del huésped.
2. Una vez establecido el reconocimiento, la región Fc, correspondiente al dominio constante del anticuerpo, se une a receptores específicos (e.g. FcγR, FcαR) en fagocitos y células presentadoras de antígenos, así como con proteínas del sistema del complemento.^[57]

En cambio, la proteína A se une con gran afinidad a la región Fc de las IgG en sentido inverso al de los receptores Fcγ presentes en las células inmunitarias como macrófagos o neutrófilos. Esta unión bloquea el acceso de los receptores FcγR a la región Fc de la inmunoglobulina, impidiendo la opsonización y la fagocitosis. Como resultado, los complejos antígeno-anticuerpo no pueden ser reconocidos por el sistema inmunitario innato, lo que permite a la bacteria S. aureus evadir la respuesta inmune.^[56][58]

Unión de la proteína A a la región Fab

Este tipo de unión ocurre en inmunoglobulinas con una región variable de cadena pesada cuya procedencia es del gen de la familia VH3.^[59][60] A diferencia de la mayoría de otras uniones en las cuales está implicada la proteína A, su unión a la región Fab se limita principalmente al dominio D.

Esta unión le permite a la proteína A actuar como un superantígeno de linfocitos B al unirse a los receptores de células B (BCR), desencadenando una activación policlonal no específica de linfocitos B. Esto provoca la apoptosis de los linfocitos B, lo que reduce la producción de anticuerpos específicos.^[61]

Tipos de interacciones químicas

La proteína A es capaz de unirse e interaccionar con otras proteínas gracias a diversas interacciones químicas que pueden ocurrir entre las moléculas implicadas:

• Las interacciones hidrofóbicas, especialmente importantes durante las unión a la región Fc de las IgG (Phe132, Tyr133 y His137 de la hélice I^[62]) y a la región Fab de las IgM, son posibles debido a la presencia de residuos aromáticos apolares, incrementando la estabilidad de la unión.^[56][50][55]
• La formación de puentes de hidrógeno incrementan la afinidad del dominio D a la región Fab. En concreto, se forman dos enlaces de hidrógeno entre Tyr-H59 y Asp-37 y entre Asn-H82a y Ser-33, además de otros dos enlaces de hidrógeno entre la cadena principal y la cadena lateral.^[56]
• Se forma un puente salino entre la región Fab y la proteína A, concretamente entre Arg-H19 y Asp-36.^[56]
• Algunas cargas eléctricas presentes en residuos de la proteína A y la IgG generan interacciones electrostáticas (Glu143, Arg146 y Lys154 de la hélice II).^[62]

IgG3 y su resistencia a la inhibición por la proteína A

En el suero humano, las inmunoglobulinas G desctacan por su abundancia y por su contribución en la defensa frente a infecciones bacterianas. Esta clase se divide en cuatro subclases: IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 (ordenadas en función de su abundancia decreciente). Las cuatro subclases difieren, entre otros aspectos, en ciertos residuos que componen su región Fc, lo que explica sus diferentes capacidades para activar la respuesta del complemento. IgG3 presenta la mayor capacidad para activar el complemento (debido a su elevada afinidad por C1q) y opsonofagocitosis, incluso en presencia de la proteína A de Staphylococcus aureus. Esto se explica debido a una sustitución puntual en el residuo 435 de su región Fc, donde la histidina presente en IgG1 (His435) es reemplazada por arginina (Arg435), que impide la interacción entre la región Fc y los dominios de unión de la proteína A. La IgG3, como consequencia, mantiene su capacidad de formar los complejos IgG-hexámero en la superficie bacteriana, pudiendo así llevar a cabo el reclutamiento de C1q.^[64]

Potencial terapéutico

Con el objetivo de poder neutralizar la actividad inmunoevasiva de la proteína A para que el sistema inmune pueda reconocer y eliminar S. aureus, se terminaron llevando a cabo investigaciones en las cuales se diseñaron variantes de proteína A en las que se mutan los residuos responsables de la unión de la proteína a las regiones Fc y Fab para poder usarlas como vacunas contra la infección de Staphylococcus aureus. Estos estudios, basados en modelos murinos, demostraron una reducción de la virulencia.^[65]

Otros trabajos más recientes utilizaron vacunas multicomponentes que incluyen proteína A detoxificada, las cuales combinan proteína A modificada con otros antígenos, en modelos más grandes (minicerdos). Los resultados también demostraron una mejora en la respuesta inmune.^[66]