Anni Matthiesen est employée à la mairie de Grindsted de 1987 à 2005, année où elle devient secrétaire politique à Christiansborg. En 2007, elle devient employée dans le secteur privé[1].
Elle est candidate une nouvelle fois lors des , et remporte cette fois-ci un siège de députée au Folketing[3]. Elle devient alors la porte-parole de son groupe parlementaire pour les friskoler (des écoles indépendantes privées) et les efterskoler (les internats volontaires pour les adolescents de 14 à 18 ans)[1].
Elle est réélue pour un second mandat lors des élections législatives de [4]. Elle devient alors porte-parole pour l'enfance, l'éducation et la nature pour la durée de la législature[1].
Elle est réélue pour un troisième en , quand son parti retourne dans l'opposition[5]. Elle devient alors la porte-parole de son groupe pour les affaires sociales et le handicap[5]. En , elle fait partie des députés de Venstre à réclamer le départ de l'ancien Premier ministre Lars Løkke Rasmussen de la présidence du parti après sa défaite aux élections de juin[6].
À l'occasion d'un remaniement dans le groupe parlementaire de Venstre en , elle quitte son rôle de porte-parole pour les affaires sociales pour prendre la présidence de la commission parlementaire sur le commerce[7].
Elle est réélue en [8]. Elle devient vice-présidente du groupe parlementaire de Venstre après le scrutin[9].
Elle est réélue pour un cinquième mandat de députée lors des élections législatives anticipées de [10]. Après le scrutin, elle perd son rôle de vice-présidente de son groupe parlementaire au profit de Thomas Danielsen mais conserve un siège à la direction du groupe en étant désignée secrétaire[11].
