アポトソーム
From Wikipedia, the free encyclopedia
アポトソーム（英: apoptosome）は、アポトーシスの過程で形成される巨大なタンパク質構造体である。アポトソームの形成は、内因性・外因性の細胞死刺激に応答してミトコンドリアから放出されたシトクロムcによって開始される。こうした細胞死をもたらす刺激には、DNA損傷やウイルス感染から、オタマジャクシの尾の消失をもたらす発生過程の指示まで多様な種類がある。
哺乳類細胞では、放出されたシトクロムcは細胞質基質のApaf-1タンパク質に結合し、アポトソームの形成を促進する。初期の生化学的研究ではシトクロムcとApaf-1が2:1で結合してアポトソームが形成されることが示唆されていたが、近年の構造解析ではシトクロムcとApaf-1の量比は1:1であることが示唆されている。3つ目の構成要素としてヌクレオチドdATPがApaf-1に結合することが示されているが、その正確な役割に関してはいまだ議論がある。哺乳類のアポトソームの結晶は得られていないが、2002年にヒトApaf-1/シトクロムcアポトソームがcryo-EMによって低分解能（20 Å）で可視化され、7回対称軸を有する車輪型構造が明らかにされた。ヒトのアポトソームの構造は中程度の分解能（9.5 Å）で解かれており、複合体中のApaf-1の各ドメイン（CARD、NB/ARC、WD40）とシトクロムcの位置が一意に特定されている。また、不活性型Apaf-1サブユニット単量体の結晶構造も得られている（PDB: 3SFZ）[1][2]。
形成されたアポトソームは、カスパーゼ-9前駆体（プロカスパーゼ-9）をリクルートして活性化する。活性化されたカスパーゼ-9は、イニシエーターカスパーゼとしてエフェクターカスパーゼを活性化し、アポトーシスにつながるカスケードを開始する。
アポトソーム（apoptosome）という用語は、辻本賀英による1998年の論文"Role of Bcl-2 family proteins in apoptosis: apoptosomes or mitochondria?"[3]で初めて導入された。一方、この用語が用いられるようになる以前から、アポトソームは"ternary complex"（三者複合体）として認識されていた。この複合体にはカスパーゼ-9とBcl-xLが関係しており、それぞれApaf-1の特定のドメインに結合するとされ、この複合体の形成は哺乳類の細胞死を調節する役割を果たすと考えられていた[4]。そして1998年12月に、Apaf-1はプロカスパーゼ-9の活性化を介してアポトーシスを調節する因子であることを示す論文が発表された[5]。
アポトソームの定義となる基準は1999年に示された。まず巨大な複合体（1.3 MDa以上）であること、そしてその形成に際してATPまたはdATPの高エネルギー結合の加水分解を必要とすること、最後にその機能的な形態においてプロカスパーゼ-9を活性化する能力を持つことである。この複合体の形成はアポトーシス過程の回帰不能点となる。Apaf-1とシトクロムからなる安定な多量体タンパク質複合体はこの基準に合致し、現在ではこの複合体がアポトソームと呼ばれている[6]。アポトソームは複数のプロカスパーゼ-9分子を近接させて互いに切断を行わせる必要があること、そしてシトクロムcの非特異的漏出によってアポトーシスが生じることがないよう活性化の閾値を高くする必要がある、という2つの理由により多量体タンパク質複合体となっていると考えられた[6]。
アポトソームがプロカスパーゼ-9の活性化因子であることが確立されると、ヒト白血病細胞、卵巣がん、ウイルス感染による不死化などにおいて、この経路の変異が重要な研究領域となった[7][8][9]。また、Apaf-1を欠損した細胞により、Apaf-1、すなわちアポトソームに非依存的な細胞死経路も存在することが示された。この経路はカスパーゼ-3やカスパーゼ-9にも依存していない[10]。
構造
アポトソームはアダプタータンパク質Apaf-1を中心として組み立てられる、複数の分子からなるホロ酵素複合体である。ミトコンドリアを介したアポトーシス経路によって組み立てられ、組み立てにはいくつかの種類のストレスシグナルによる刺激が必要である。
アポトソームが形成されるためには、ATP/dATPとシトクロムcが細胞質基質に存在することが必要である[11]。ストレス刺激によってシトクロムcの細胞質への放出が開始され、シトクロムcはApaf-1のC末端に位置する、複数のWD40リピートからなる領域に結合する[12]。Apaf-1のオリゴマー化は、N末端のCARDモチーフへのプロカスパーゼ-9のリクルートを伴って生じるようである[12]。アポトソームは、アポトーシスの内因性経路におけるカスパーゼの活性化を開始する[11]。
7回対称軸を有するアポトソームの車輪型七量体複合体構造はクライオ電顕によって27 Åの分解能で初めて明らかにされ、この複合体のサイズは約1 MDaと計算された[12]。この車輪型粒子には、7個のスポークからなる中心部のハブが存在する。スポークの遠位部にはY字型構造が存在する[11]。ハブドメインは曲がったアームによって、このYドメインと連結されている。各Yドメインは大小2つのローブから構成され、シトクロムcの結合部位は2つのローブの間に位置する[11]。このアポトソーム構造の分解能は比較的低かったため、アポトソームの構成に関して2つの対立するモデルが提唱された。1つのモデルでは、NODドメイン（nucleotide-binding and oligomerization domain）が中心部のハブを形成し、CARDドメインはその上部で比較的遊離した形でリングを形成するとされた[12]。もう一方のモデルでは、Apaf-1は伸長した形で複合体を形成しており、N末端のCARDとヌクレオチド結合領域が中心部のハブを形成し、13個のWD40リピートが2つのローブを構成する。そして大きなローブは7個のリピート、小さなローブは6個のリピートから構成される。各カスパーゼ-9分子は中心部のハブに位置するCARDドメインに結合し、ドーム型構造を形成するとされた[11]。この論争は、ヒトアポトソーム/プロカスパーゼ-9 CARD複合体の高分解能構造によって解決された[1]。アポトソームがプロカスパーゼ-9を結合すると、Apaf-1のCARDとプロカスパーゼ-9のCARDはアポトソームのプラットフォーム構造の上に柔軟なディスク様構造を形成する[1]。WD40リピートの数も13個ではなく15個であり、7枚のブレードからなるβプロペラと8枚のブレードからなるβプロペラを構成することが示された[1]。
複合体内のプロカスパーゼ-9とApaf-1の量比はおよそ1:1であることが生化学的解析から示され[6]、さらに定量的な質量分析によって確証された[13]。また、Apaf-1とシトクロムcの量比も1:1であることが示された[1]。アポトソームへのシトクロムcの安定的な取り込みはApaf-1のオリゴマー化後である必要があるかどうかに関しては多少の議論があるが、近年の構造データはシトクロムcがヒトアポトソームのオリゴマー化状態を安定化するという考えを支持している[1]。しかしながら、線虫やショウジョウバエといった哺乳類以外の生物種では、アポトソームの組み立てにシトクロムcは必要ではない可能性がある[14]。また、他の分子、最も特筆すべきものとしてはカスパーゼ-3がアポトソームと共精製されることが報告されており[6]、アポトソーム/プロカスパーゼ-9複合体に結合可能であることが示されている[13]。
Apaf-1はアポトソームの骨格を形成する。Apaf-1には、N末端のカスパーゼリクルートドメイン（CARD、1–90番残基）、中心部のヌクレオチド結合・オリゴマー化領域（NB-ARC/NOD、128–586番残基）、C末端のWD40領域（613–1248番残基）という主に3つの領域が存在し、各単量体のサイズは約140 kDaである[12]。
N末端のCARDドメインには短いリンカーとヌクレオチド結合ドメイン（NBD）が続く。NBDには保存されたWalkerボックスA（Pループ、155–161番残基）とB（239–243番残基）が含まれている[12]。WalkerボックスA/BはdATP/ATPとMg2+の結合に重要である[1][12]。NBDの後には小さなヘリカルドメイン（HD1）、2つ目のリンカー、そして保存されたウィングドヘリックスドメイン（WHD）が続く[12]。NBD、HD1、WHDはNOD領域を構成し、AAA+ファミリーに属するATPアーゼドメインを構成する[1][12]。NOD領域とWD40領域の間にはスーパーヘリカルドメイン（HD2）が存在する[1]。WD40領域はそれぞれ8つと7つのブレードからなる2つのβプロペラを形成し、両者の間はリンカーで連結されている[1]。
