Metatranscriptómica

El microbioma se ha definido como una comunidad microbiana que ocupa un hábitat bien definido. Son ubicuos y extremadamente relevantes para el mantenimiento de la característica del entorno en el que residen y un desequilibrio en estas comunidades puede afectar negativamente la actividad del entorno en el que residen. Para estudiar estas comunidades, y luego determinar su impacto y correlación con su nicho, diferentes ómicas se han utilizado enfoques. Mientras que la metagenómica permite obtener un perfil taxonómico de la muestra, la metatrascriptómica proporciona un perfil funcional al analizar qué genes son expresados por la comunidad. Es posible inferir qué genes se expresan en condiciones específicas, y esto se puede hacer utilizando anotaciones funcionales de genes expresados.^[3]

Dado que la metatranscriptómica se centra en qué genes se expresan, permite comprender el perfil funcional activo de toda la comunidad microbiana. La descripción general de la expresión génica en una muestra determinada se obtiene capturando el ARNm total del microbioma y realizando una secuenciación completa de metatranscriptómica.^[4]

Aunque las micromatrices se pueden aprovechar para determinar los perfiles de expresión génica de algunos organismos modelo, la secuenciación de próxima generación y la secuenciación de tercera generación son las técnicas preferidas en la metatranscriptómica. El protocolo que se utiliza para realizar un análisis de metatranscriptoma puede variar según el tipo de muestra que se deba analizar. De hecho, se han desarrollado muchos protocolos diferentes para estudiar el metatranscriptoma de muestras microbianas. Generalmente, los pasos incluyen recolección de muestras, extracción de ARN (se han informado en la literatura diferentes métodos de extracción para diferentes tipos de muestras), enriquecimiento de ARNm, síntesis de ADNc y preparación de bibliotecas metatranscriptómicas, secuenciación y procesamiento y análisis de datos. El enriquecimiento de ARNm es una de las partes más complicadas. Se han propuesto diferentes estrategias:^[5][6]

• eliminar el ARNr a través de la captura de ARN ribosómico utilizando una exonucleasa 5-3 para degradar los ARN procesados (principalmente ARNr y ARNt).
• agregar pol (A) a los ARNm mediante el uso de una polimerasa polA (en Escherichia coli)
• usando anticuerpos para capturar ARNm que se unen a proteínas específicas

Las dos últimas estrategias no se recomiendan ya que se ha informado que están muy sesgadas.

Una canalización típica de análisis de metatranscriptomas:^[7]

• el mapa lee a un genoma de referencia o
• realiza el ensamblaje de novo de las lecturas en contigs y supercontigs de transcripción.

El primer mapa de estrategia se lee para hacer referencia a los genomas en las bases de datos, para recopilar información que sea útil para deducir la expresión relativa de los genes individuales. Las lecturas metatranscriptómicas se asignan a las bases de datos utilizando herramientas de alineación, como Bowtie2, BWA y BLAST. Luego, los resultados se anotan utilizando recursos, como GO, KEGG, COG y Swiss-Prot. El análisis final de los resultados se realiza en función del objetivo del estudio. Una de las últimas técnicas de metatranscriptómica es el sondeo de isótopos estables (SIP), que se ha utilizado para recuperar transcriptomas dirigidos específicos de microbios aeróbicos en sedimentos de lago. La limitación de esta estrategia es su dependencia de la información de los genomas de referencia en las bases de datos.^[8]

La segunda estrategia recupera la abundancia en la expresión de los diferentes genes ensamblando lecturas metatranscriptómicas en fragmentos más largos llamados contigs utilizando diferentes softwares. Entonces, sus límites dependen del software que se utilice para el ensamblaje. Se informó que el software Trinity para ARN-seq, en comparación con otros ensambladores de transcriptomas de novo, recuperaba más transcripciones de longitud completa en una amplia gama de niveles de expresión, con una sensibilidad similar a los métodos que se basan en alineaciones del genoma. Esto es particularmente importante en ausencia de un genoma de referencia.^[9][10]

Li y Dewey desarrollaron una tubería cuantitativa para el análisis transcriptómico y la denominaron RSEM. Puede funcionar como software independiente o como complemento para Trinity. RSEM comienza con un transcriptoma o ensamblaje de referencia junto con las lecturas de ARN-Seq generadas a partir de la muestra y calcula la abundancia de transcripción normalizada (es decir, el número de lecturas de ARN-Seq correspondientes a cada transcriptoma o ensamblaje de referencia).^[11]

Aunque tanto Trinity como RSEM fueron diseñados para conjuntos de datos transcriptómicos (es decir, obtenidos de un solo organismo), es posible aplicarlos a datos metatranscriptómicos (es decir, obtenidos de una comunidad microbiana completa).^[12]

Dada la enorme cantidad de datos obtenidos a partir del análisis metagenómico y metatranscriptómico, el uso de herramientas bioinformáticas ha cobrado mayor importancia en las últimas décadas. Para lograrlo, se han desarrollado muchos pipelines bioinformáticos diferentes, a menudo como plataformas de código abierto, como HUMAnN y las más recientes HUMAnN2, MetaTrans, SAMSA, Leimena-2013 y mOTUs2.^[13]

HUMAnN2 es un pipeline bioinformático diseñado a partir de este último HUMAnN desarrollado en el Proyecto de Microbioma Humano (HMP), que implementa un enfoque de "búsqueda por niveles". En el primer nivel, HUMAnN2 analiza las lecturas de ADN o ARN con MetaPhlAn2 para identificar microbios ya conocidos y construir una base de datos específica de muestras fusionando pangenomas de especies anotadas; en el segundo nivel, el algoritmo realiza un mapeo de las lecturas con la base de datos de pangenoma ensamblada; en el tercer nivel, las lecturas no alineadas se utilizan para una búsqueda traducida contra una base de datos de proteínas.^[14]

MetaTrans es una tubería que explota ordenadores de subprocesos múltiples para mejorar el análisis metagenómico y metatranscriptómico. Los datos se obtienen de ARN-Seq de extremos emparejados, principalmente de ARNr 16S para la taxonomía y ARNm para niveles de expresión génica. La tubería se divide en 4 pasos principales. En primer lugar, las lecturas de los extremos emparejados se filtran con fines de control de calidad, para luego ser clasificadas para análisis taxonómico (por eliminación de secuencias de ARNt) o análisis funcional (por eliminación de secuenciación tanto de ARNt como de ARNr). Para el análisis taxonómico, las secuencias se mapean contra la base de datos ARNr 16S Genesverdes v13.5 usando SOAP2, mientras que para el análisis funcional las secuencias se mapean contra una base de datos funcional como MetaHIT-2014 siempre usando la herramienta SOAP2. Esta canalización es muy flexible, ya que ofrece la posibilidad de utilizar herramientas de terceros y mejorar módulos individuales siempre que se mantenga la estructura general.^[15]

Esta canalización está diseñada específicamente para el análisis de datos de metatranscriptómica, trabajando en conjunto con el servidor MG-RAST para metagenómica. Esta canalización es fácil de usar, requiere poca preparación técnica y poder computacional y se puede aplicar a una amplia gama de microbios. El algoritmo se divide en 4 pasos. Al principio, las secuencias de los datos de secuenciación sin procesar se seleccionan en función de la calidad y luego se envían a MG-RAST (que prevé diferentes pasos, como verificación de control de calidad, llamada de genes, agrupamiento de secuencias de aminoácidos y uso de sBLAT en cada grupo para detectar el mejores partidos). Luego, las coincidencias se agregan con fines de análisis taxonómico y funcional, que generalmente siguen como los últimos pasos del proceso.^[16]

Esta canalización en realidad no tiene un nombre, por lo que generalmente se cuenta con el nombre del autor del artículo en el que se describe. Este algoritmo prevé la implementación de herramientas de alineación como BLAST y MegaBLAST. Las lecturas, que generalmente se obtienen mediante la secuenciación de Illumina, se agrupan en grupos de lecturas idénticas y luego se procesan para la eliminación in-silico de secuencias de ARNt y ARNr. Las lecturas restantes se mapean luego en la base de datos de NCBI mediante el uso de herramientas BLAST y MegaBLAST y se clasifican por su puntaje de bits. Las secuencias de bitscore más altas se interpretan por tanto para predecir el origen y la función filogenéticos. En cambio, las lecturas de puntuación más baja se alinean con BLASTX (mayor sensibilidad) y, finalmente, se pueden alinear en bases de datos de proteínas para que se pueda caracterizar su función.^[17]

El perfilador mOTUs2, se basa en genes esenciales de mantenimiento, es demostrablemente adecuado para la cuantificación de la actividad transcripcional basal de los miembros de una comunidad microbiana. Dependiendo de las condiciones ambientales, el número de transcripciones por célula varía para la mayoría de los genes. Una excepción a esto son los genes de mantenimiento que se expresan constitutivamente y con baja variabilidad en diferentes condiciones. Por tanto, la abundancia de transcripciones de dichos genes se correlaciona fuertemente con la abundancia de células activas en una comunidad.^[18]

Otro método que puede explotarse con fines metatranscriptómicos es Tiling Microarrays. En particular, se han utilizado microarrays para medir los niveles de transcripción microbiana, para detectar nuevas transcripciones y para obtener información sobre la estructura de los ARNm (por ejemplo, los límites de UTR). Recientemente, también se ha utilizado para encontrar nuevos ARNc reguladores. Sin embargo, los microarrays se ven afectados por algunas dificultades:^[19]

• requisito del diseño de la sonda
• baja sensibilidad
• conocimiento previo de los genes diana.

ARN-Seq puede superar estas limitaciones: no requiere ningún conocimiento previo sobre los genomas que deben analizarse y proporciona una validación de alto rendimiento de la predicción, estructura y expresión de genes. Por tanto, al combinar los dos enfoques es posible tener una representación más completa del transcriptoma bacteriano.