Le jeu dispose de trente-huit personnages jouables. Dix-huit d'entre eux sont disponibles dès le début, tandis que vingt autres sont à débloquer. Certains personnages comme Carottin, Goomba, Bébé Luigi, Bébé Wario et Plante Piranha sont jouables pour la première fois dans la série, et Bébé Waluigi fait sa toute première apparition dans l'univers Super Mario.
Les personnages sont répartis selon six catégories influençant leurs statistiques et leur façon de jouer. Ainsi, un personnage complet dispose de statistiques plutôt équilibrées, alors qu'un type technique a tendance à mieux envoyer les balles dans les coins du court. De même, le type défense voit ses réceptions de balles facilitées, tandis qu'un type puissance peut envoyer des coups rapides au détriment de sa vitesse. Enfin, un type ruse envoie des balles dont la trajectoire est incurvée, rendant ainsi sa direction plus aléatoire, et un type vitesse bénéficie d'un excellente vitesse de déplacement sur le terrain.
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Personnages jouables de Mario Tennis Fever
| Complet |
Vitesse |
Technique |
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| Puissance |
Défense |
Ruse |
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