Microscopie de fluorescence supercritique
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La microscopie de fluorescence supercritique (SAF, Supercritical angle fluorescence microscopy) est une technique particulière de microscopie optique à fluorescence permettant l'observation spécifique d'une tranche supérieure ultra fine d'un échantillon (moins de 100 nm d'épaisseur). Cette technique, plus sélective encore que la microscopie de fluorescence par réflexion totale interne (TIRF, limitée à 200 nm), permet de dépasser les limites théoriques que devrait imposer la diffraction de la lumière grâce à une observation dans les angles supercritiques. La méthode a été inventée en 1998 dans les laboratoires de Stefan Seeger[1] à l'université de Ratisbonne en Allemagne et plus tard à l'université de Zurich en Suisse.
La microscopie SAF utilise une particularité des diffusions de lumière très proches d'une surface de verre. En effet, le comportement de rayonnement des molécules fluorescentes est fortement influencé lorsqu'elles se trouvent à proximité immédiate d'interfaces d'indices de réfraction différents[2],[3]. Ainsi, Lorsqu'une particule fluorescente s'approche fortement de la surface de verre, elle n'émet pas de lumière dans toutes les directions (on dit qu'il n'y a pas d'émission isotrope). Environ 70% de la fluorescence émise se trouve alors dirigée dans le verre au-dessus de l'angle critique[1] (angle à partir duquel la lumière n'est plus réfractée mais est réfléchie entre le verre et l'eau de l'échantillon[4]). A contrario, si la distance de l'émetteur fluorescent s'éloigne à seulement 200 nm au-dessus de la surface, la lumière fluorescente pénétrant dans le verre au-dessus de l'angle critique diminue considérablement. Par conséquent, la microscopie SAF est idéalement adaptée pour distinguer les molécules et les particules sur ou à proximité des surfaces et de tout autre échantillon présent dans la masse [5],[6].
Utilisation
Les microscopes SAF permettent d'observer des processus membranaires et d'adhésion dans les cellules vivantes[7] en détectant et caractérisant les espèces fluorescentes (protéines, biomolécules, produits pharmaceutiques, etc.) et leurs comportements proches voire adsorbés ou liés en surface. La méthode est capable d'observer des molécules à une distance de 100 à 0 nanomètre de la surface, même en présence de fortes concentrations d'espèces fluorescentes aux alentours.
En combinant deux dispositifs sur l'objectif du microscope, la technique SAF permet la détection séparée de la fluorescence de la masse de l'échantillon (détectée par les microscopes à fluorescences classiques) et de sa zone de contact avec le verre de support (lame de microscope) dont la lumière est émise au-dessus de l'angle critique. Dans le cas de l'observation d'une cellule vivante, cette double observation permet de bien séparer les processus membranaires du reste corps cellulaire.
En plus de cette utilisation, la microscopie SAF pourrait permettre de mesurer l'indice de réfraction d'une cellule[8] et par ce biais la présence de bactérie sans marquage fluorescent dans un échantillon extrêmement petit[9].
