ゲル内消化

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基本的には脱染色・還元アルキル化・タンパク質分解・抽出の4ステップで構成される。

ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離されたタンパク質は、通常CBBのような色素や銀染色などによって可視化される。その状態で目的タンパク質を切り抜き、脱染色してから解析を進めることになる。

CBBの脱染色にはアセトニトリルなどの有機溶媒を加えた重炭酸アンモニウム(NH₄HCO₃)緩衝液が用いられる。有機溶媒によりタンパク質との疎水的相互作用が緩和され^[5]、一方緩衝作用により正に帯電したアミノ酸とのイオン結合が弱められることで、CBBが取り除かれやすくなる。 また脱染過程は温度を上げることで促進される^[6]。なお脱染によりある程度（1割以下）のタンパク質が失われる^[7]。CBBの除去は最終的なペプチド収量には影響しない^[8]。

銀染色されたタンパク質の場合、フェリシアン化カリウムや過酸化水素によって銀を酸化し、生じた銀イオンをチオ硫酸ナトリウムに配位させて取り除く^[9][10]。

続いてシスチンを還元しシステインをアルキル化する。これによりタンパク質にジスルフィド結合が存在していたとしても不可逆的に解離することになり、タンパク質分解に適したほどけた構造になる。還元にはジチオトレイトール(DTT)や塩酸トリス2-カルボキシエチルフォスフィン(TCEP)のように、スルヒドリル基やフォスフィン基をもつ化合物が用いられる。その後ヨードアセトアミドを用いてチオール基をアルキル化することで、システインはS-カルボキシアミドメチルシステイン（分子量160.03）となる。

この化学修飾により、ジスルフィド結合の多いタンパク質でも、高い収率と配列カバー率で同定することができるようになる^[11][12]。もっともたいていのタンパク質ではシステインはそれほど多くないため、還元アルキル化処理が同定結果に大きな影響を及ぼすことはない^{[2][7][13][14]}。 定量的で均一なアルキル化のためには修飾するタイミングが重要である。変性条件で電気泳動する場合、電気泳動の前にアルキル化することが推奨される。これはゲル中に存在するアクリルアミド単量体がシステインを修飾してしまう恐れがあるからである^{[15][16][17][18]}。 これによって生じるアクリルアミド付加体（分子量174.05）は取り除くことができない。この場合、チオール基の保護をアクリルアミド修飾で統一することにより、質量分析時のダブルピークを避けることができる^[19]。またPMF法などの場合には、データベース検索の際にアクリルアミド修飾の可能性を疑うことにより、ペプチド断片の質量変化をある程度吸収することができる。

次がゲル内消化という名の由来となるステップである。タンパク質は酵素によって少数のペプチド断片へと分解される。タンパク質ごとにどんな質量の断片が生じるかに特徴があるため、これを利用してタンパク質を同定するのである。タンパク質分解酵素としてはセリンプロテアーゼの一種トリプシンが頻用されている。トリプシンは塩基性アミノ酸（アルギニンとリジン）のC末端側のペプチド結合を特異的に切断する。ただしペプチド結合の相手が酸性アミノ酸（アスパラギン酸とグルタミン酸）である場合には効率が落ち、プロリンの場合には切断されない^[20]。

タンパク質分解酵素を使うことによる望ましくない副作用として、酵素の自己消化がある。かつては反応液中にカルシウムイオンを加えることでこれを抑えていた^[21][22]。現在はリジン残基の選択的メチル化によりアルギニン消化部位の自己消化活性を抑えたトリプシンが供給されている^[23] トリプシンの至適温度は元来35°Cから45°Cだが、この修飾により50°Cから55°Cに変わる。^[13][24]。

ゲル内消化に使われる酵素としては他にも、エンドペプチダーゼのLys-C^[25][26][27]、Glu-C^[28][29][30]、Asp-N^[31]、Lys-N^[32][33]がある。こうした酵素はそれぞれ1種のアミノ酸で特異的に切断するため、より長く少数のペプチド断片が得られる。タンパク質の一次構造（アミノ酸配列）を完全に決定する場合は、通常1種類の酵素だけでは不可能であり、異なる酵素を使った解析を組み合わせることが必要になる^[28][34][35]。

ゲルマトリックス中に閉じ込められているタンパク質を分解するためには、酵素がタンパク質と接する必要がある。そこでゲル断片をアセトニトリルで脱水してから酵素を含むバッファーで膨潤させることでゲル中に酵素が浸透されると考えられている^[36]。しかしゲルへの酵素の浸透を解析したいくつかの研究によれば、この過程は膨潤とは関係なく単なる拡散によって起きていることが示されている^[4][13]。したがって、ゲル内消化の効率改善にはタンパク質までの距離を短くすること、たとえばゲル片を小さく刻むことが必要になる。

通常ゲル内消化には一晩かける。トリプシンを用いて37°Cで反応させる場合はたいてい12-15時間をかけている。しかし時間を追って検討した実験によれば、3時間でも質量分析には充分であることが示されている。^[37]さらに温度やpH、添加物などの反応条件を最適化すれば30分で反応を終えることもできる^[13]。

界面活性剤があるとゲル中でのタンパク質の変性を促進することができ、その結果反応時間の短縮、分解の促進、またとくに膜タンパク質のような疎水的タンパク質の場合は抽出されるペプチドの収量増大などにつながる。この場合、質量分析の邪魔にならないように、オクチルグルコシドや、PPSのような酸性条件下で開裂するような界面活性剤を用いる。

最後にタンパク質分解で生じたペプチド断片をゲル中から抽出する必要がある。ゲル片に抽出溶液を加えて上清を回収すれば良く、これを複数回繰り返すことがよく行われている。 ただし1回目の抽出でほとんどのペプチドが回収され、2回以上繰り返しても収量はせいぜい5-10%ほどしか増えない^[7]。物理化学的性質の異なるペプチドを抽出するためにさらに条件を変えて抽出を行う。酸性のペプチドには分解反応の時と似た組成の溶液を用い、塩基性のペプチドには低張な酸性溶液（ESIにはギ酸、MALDIにはTFA）を用いる。モデルタンパク質を使った研究によれば、ゲルからの抽出効率はおよそ7-8割である^[7]。多くのプロトコルでは抽出溶液に30%以上のアセトニトリルを加えており、これによってペプチドが反応チューブやピペットチップに吸着するのを抑えている^[38]。回収した抽出液をまとめ、遠心濃縮機で濃縮ないし乾燥させる。乾燥させたペプチドは-20°Cで6ヶ月以上保存可能である。

ゲル内消化に特有の利点としては、ポリアクリルアミドのゲルが微量のタンパク質の取り扱い容器として優れていることがあげられる。しばしばフェムトモルオーダーという微量なタンパク質を取り扱うことになるが、タンパク質がチューブやピペットチップなどの表面に吸着して失われてしまうリスクがある。しかしゲル中に捉えられた状態ならばこうした問題は起きにくい。またゲル内はタンパク質と消化酵素の接触効率が良く、処理に必要な酵素の量を節約できるという利点もある^[39]。そもそも電気泳動後のタンパク質をゲルから出すには、ゲルを電場の中に置いたり透析を行ったりしなければならないが、消化後のペプチド断片であれば容易に溶出できるということもある^[39]。