外観は、マルタ石の名で知られるマルタ島産の石灰岩を使用している。バロック様式の内装は、カラブリア出身のマルタ騎士団員で画家のマッティア・プレッティの手によるものが大部分を占めている。プレッティは精巧に刻まれた石の壁を設計し、ヴォールト天井と祭壇の両側を聖ヨハネの生涯を描いた絵画で埋めつくした。
教会の本堂には、重要な騎士たちが眠る、大理石でできた墓石が並んでいる。最重要の騎士たちは教会の全面近くに埋葬されている。これらの墓石は豊かな装飾がなされ、石の下に埋葬されている騎士の似姿と同様にその紋章が彫られ、時には戦勝の物語を記している。
聖堂内の礼拝堂は、騎士団を構成した騎士が8言語ごとの騎士館に分けられていたのにならい8つあり（イングランド及びバイエルン、フランス、プロヴァンス、オーヴェルニュ、イタリア、ドイツ、アラゴン、カスティーリャ）、それぞれの守護聖人に献堂されている。
小礼拝堂に展示されている絵画『洗礼者聖ヨハネの斬首』（カラヴァッジオ作）は、教会内で最も有名な作品である。カラヴァッジオの傑作の一つで、画家本人の署名がされた唯一の作品である。
