慶長19年（1614年）からの大坂の陣では父と共に参戦する。後に相模国内で500石、さらに甲斐国内などで800石を与えられ、寛永11年（1634年）5月には御使番、同年8月には大坂目付となった。寛永13年（1636年）、父の死去により家督を継ぐが、このときに父の遺言で3000石を弟の長広（三須田蒔田家）に分与したため、定正は8316石の旗本となった。
その後、駿府目付や池田光仲の目付などを務める。寛永17年（1640年）12月29日、因幡国から帰国中の近江国草津にて死去した。享年50。後を嫡男の定行が継いだ。